丁基苯酞對創傷性腦損傷模型大鼠神經功能的改善作用*

何 云，桂水清，黃賢鍵，朱棟梁

（廣東省深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518035）

創傷性腦損傷（TBI）已成為嚴重的公共衛生問題，但目前尚缺乏有效的治療方法［1］。除了在創傷事件發生后立即發生原發性機械損傷外，還會繼發腦損傷神經細胞死亡［2］。在中樞神經系統（CNS）中，蛋白激酶C 受體1（RACK1）可募集并結合許多激酶和受體，從而達到保護神經細胞的目的［3］。近端內質網應激傳感器肌醇酶1（IRE1）信號通路的激活也可通過RACK1 的直接結合而觸發［4］。激活的IRE1 通過編碼轉錄因子X-box 結合蛋白1（XBP1）發揮作用，并協調如葡萄糖調節蛋白78（GRP78）等未折疊蛋白反應（UPR）基因的表達［5］。有研究表明，IRE1／XBP1 信號通路在CNS 疾病中可預防神經細胞凋亡。低表達的XBP1 可抑制神經細胞中淀粉樣β 神經毒性，而XBP1 的過表達會觸發帕金森病模型小鼠中多巴胺能神經細胞的變性［6-7］。丁基苯酞（NBP）已被批準用于預防腦缺血［8］，但尚不清楚NBP 是否對TBI模型大鼠的神經功能有改善作用，本研究中擬就此問題進行探討。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：HBS-1096B 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；ASP300S 型組織脫水機、1150 型包埋機、RM2255 型全自動輪轉切片機（德國Leica 公司）；E400 型光學顯微鏡（日本Nikon 公司）；GelDoc-It2 310型凝膠成像儀（美國UVP 公司）；165-8033 型垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

試劑：NBP（美國Sigma 公司）；蘇木素染色液（上海碧云天生物技術研究所）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自上海生工生物工程有限公司；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RACK1、磷 酸 化 IRE1（p - IRE1）、XBP1、GRP78、β-actin 抗體（美國Santa Cruz 公司）；純化山羊抗小鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司）；水為純化水。

動物：SD 大鼠，雄性，體質量（200±20）g，購自吉林大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（吉）2017-0001，動物質量合格證號為2018112304。在環境溫度（23±2）℃，相對濕度60% ～70%，光照12 h 明暗交替環境中適應性喂養1 周后進行試驗。

1.2 方法

模型制備及分組、給藥：將60 只大鼠分為假手術組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），NBP 低、中、高劑量組（10，20，40 mg／kg），各12 只。采用改良Feeney 自由落體撞擊法制備大鼠TBI 模型。麻醉后將大鼠俯臥固定在立體定位儀上，備皮消毒后切開頭部皮膚，于冠狀縫后中線右側開3 cm 磨取5 mm 的骨窗，用顱腦撞擊器在硬腦膜上放置1 個與骨孔大小吻合的墊片及直徑4 mm 的撞針，用40 g 砝碼從40 cm 高處自由落體撞擊撞針，造成大鼠右側大腦半球腦挫裂傷。假手術組只磨取骨窗，不予撞擊。縫合切口，待大鼠麻醉清醒后，各組大鼠分別腹腔注射相應藥物（注射體積每100 g體質量2 mL），每日1 次，連續7 d［9］。

神經功能缺損評分：末次給藥1 h 后評估神經功能，完全無法走路計5 分，無法自發行走和失去知覺計4 分，走路時向內傾斜計3 分，走路時向內旋轉計2 分，前爪無法完全伸展計1 分，無神經功能障礙表現計0 分。

腦組織含水量檢測：處死大鼠，取腦組織，去除軟腦膜和凝血塊，每組4 只以福爾馬林固定，4 只以液氮保存，4 只進行腦含水量測定。取右側腦半球，稱定體質量后置60 ℃烤箱中烤至恒重，再次稱定質量，計算腦組織含水量。含水量＝（濕質量-干質量）／濕質量×100%。

腦細胞凋亡檢測：制備常規腦組織病理石蠟切片，經二甲苯脫蠟和無水乙醇脫水后，以TUNEL 法采用熒光顯微鏡檢測凋亡細胞，以碘化丙啶（DAPI）反染細胞核，計算陽性細胞率。

MDA 和SOD 水平檢測：制備腦組織勻漿，吸取上清液，按酶聯免疫吸附法測定MDA 和SOD 水平。

RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表達水平檢測：采用western blot 法。制備腦組織勻漿，取50 mg，加入1 mL預冷蛋白抽提試劑，冰浴2 h，離心，取上清液，100 ℃煮10 min 進行變性。各組取20 μg 上樣，轉模，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入RACK1（1 ∶400）、p - IRE 1（1 ∶200）、XBP1（1 ∶200）、GRP78（1 ∶300）一抗，4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST 清洗2 次，加入二抗（1 ∶5 000），在室溫下孵育30 min，回收二抗，TBST 清洗3 次，加入ECL 化學發光試劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J 軟件將條帶灰度值數字化，目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析。定量資料以表示，行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對神經功能缺損評分和腦組織含水量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分和腦組織含水量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 高、中、低劑量組大鼠神經功能缺損評分和腦組織含水量顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 對腦細胞凋亡的影響

與假手術組大鼠細胞凋亡指數［（0.48±0.17）%］比較，模型組大鼠［（6.30±0.52）%］顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠凋亡指數［（3.62±0.48）% ，（2.51±0.37）% ，（1.10±0.27）% ］均顯著降低，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 對腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織勻漿中MDA水平顯著升高，SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠腦組織勻漿中MDA水平顯著降低，SOD 水平顯著升高，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見表2。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分和腦組織含水量比較（±s，n ＝4）Tab.1 Comparison of neurological deficit score and brain water content of rats in each group（±s，n ＝4）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分和腦組織含水量比較（±s，n ＝4）Tab.1 Comparison of neurological deficit score and brain water content of rats in each group（±s，n ＝4）

注：與假手術組比較，a P ＜0.05；與模型組比較，b P ＜0.05；與NBP 低劑量組比較，c P ＜0.05；與NBP 中劑量組比較，d P ＜0.05。表2、表3 同。Note：Compared with those in the sham operation group，a P ＜0.05；compared with those in the model group，b P ＜0.05；compared with those in the NBP low-dose group，c P ＜ 0.05；compared with those in the NBP medium-dose group，d P ＜0.05；as well as Tab.2 and Tab.3.

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40神經功能缺損評分（分）0 3.40±0.28a 2.84±0.36b 1.88±0.27bc 1.15±0.12bcd腦組織含水量（%）77.54±0.28 82.23±0.49a 80.68±0.51b 79.25±0.35bc 78.91±0.41bcd

2.4 對 腦 組 織 勻 漿 中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78 表達水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織勻漿中RACK1 水平顯著降低，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，NBP 低、中、高劑量組大鼠腦組織勻漿中RACK1 水平顯著升高，p-IRE1，XBP1，GRP78 水平均顯著降低，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）。詳見表3 及圖2。

A. 假手術組 B. 模型組 C.NBP 低劑量組 D.NBP 中劑量組 E.NBP 高劑量組圖1 大鼠腦細胞凋亡情況A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.1 Apoptosis of brain cells of rats

表2 各組大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平比較（±s，n ＝4）Tab.2 Comparison of MDA and SOD levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

表2 各組大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 水平比較（±s，n ＝4）Tab.2 Comparison of MDA and SOD levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40 MDA（nmol／mg）4.78±0.57 12.09±1.82a 9.52±0.43b 7.68±0.83bc 6.02±0.70bcd SOD（U／g）24.35±3.42 7.34±0.40a 9.75±0.98b 13.84±2.46bc 17.28±3.61bcd

表3 各組大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平比較（±s，n ＝4）Tab.3 Comparison of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 expression levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

表3 各組大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平比較（±s，n ＝4）Tab.3 Comparison of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 expression levels in brain homogenate of rats in each group（±s，n ＝4）

組別假手術組模型組NBP 低劑量組NBP 中劑量組NBP 高劑量組劑量（mg／kg）10 20 40 RACK1 3.28±0.41 0.62±0.07a 1.28±0.25b 1.83±0.37bc 2.69±0.13bcd p-IRE1 0.42±0.05 1.82±0.29a 1.53±0.09b 1.30±0.21bc 0.94±0.08bcd XBP1 0.45±0.07 1.27±0.28a 0.85±0.14b 0.73±0.09bc 0.55±0.06bcd GRP78 0.19±0.04 1.76±0.18a 1.27±0.25b 0.54±0.04bc 0.33±0.05bcd

3 討論

TBI 24 h 后，外傷皮質周圍氧化產物（MDA）水平升高，抗氧化酶活性減弱［10］。本研究中，NBP 可減輕TBI模型大鼠的氧化應激水平，減輕腦水腫癥狀，并改善神經功能評分，抑制神經細胞凋亡。氧化應激在TBI 病理過程中扮演重要作用。為了緩解氧化應激，細胞激活UPR 級聯反應，其目的是通過減少錯誤折疊蛋白的負荷來重建內質網蛋白穩定，抑制細胞凋亡［11］。最保守的UPR 信號傳導途徑是由IRE1 的激活引發的，IRE1 在增強細胞存活中起關鍵作用［12］。RACK1 是IRE1 信號傳導的關鍵調節劑。敲除RACK1 的阿爾茨海默病（AD）模型，小鼠的大量神經細胞凋亡和神經功能損傷［13］。本研究中TBI 模型大鼠腦組織中RACK1 水平降低，與上述研究一致。相反，RACK1 過表達可顯著改善腦外傷后的繼發性腦損傷，NBP 可提高腦組織中RACK1 水平［14］。RACK1 的神經保護作用可能是通過激活IRE1 磷酸化來實現的，一旦被激活，IRE1 作為跨膜激酶催化去除編碼XBP1 的內含子，產生剪接的XBP1 mRNA，產生功能性XBP1 蛋白［15］。RE1 磷酸化導致了功能性轉錄因子XBP1 及其下游靶基因GRP78 的產生［16］。RACK1 以葡萄糖刺激或氧化應激反應的方式與IRE1 相互作用，從而激活IRE1。有研究使用IRE1 抑制劑十二烷基苯磺酸（DBSA）進行論證性研究，結果顯示，DBSA 特異性降低IRE1 磷酸化水平而抑制IRE1 的激活［17］。XBP1 充當轉錄因子，結合細胞核中的應激元件啟動子并促進GRP78 表達，以恢復蛋白質的正確構象，并維持神經細胞穩態。研究表明，磷酸化的IRE1 和XBP1 表達在試驗性腦缺血和創傷后應激障礙模型動物中增加，并促進神經細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，NBP 抑制了IRE1／XBP1 信號通路，降低了腦組織中GRP78 水平。

A. 假手術組 B. 模型組 C.NBP 低劑量組D.NBP 中劑量組 E.NBP 高劑量組圖2 大鼠腦組織勻漿中RACK1，p-IRE1，XBP1，GRP78表達水平A.Sham operation group B.Model group C.NBP low-dose group D.NBP medium-dose group E.NBP high-dose groupFig.2 Expression levels of RACK1，p-IRE1，XBP1 and GRP78 in brain homogenate of rats in each group

綜上所述，NBP 對TBI 模型大鼠神經功能有一定改善作用，其機制與抑制IRE1／XBP1 信號通路有關。