Raw264.7細胞蛋白和PD-L1抗體在小鼠黑色素瘤(B16)中的抑瘤效果評價

吳沙沙 牟大超 繆治永 焦 令 周 軼

當前，由于環境污染、生活方式改變、病原體感染等因素，腫瘤已成為成為人類死亡的最大致病因素，嚴重影響著人類健康和經濟發展[1-3]。隨著基礎免疫學的發展和對腫瘤認識的深入，腫瘤免疫治療已成為繼手術治療、放療和化療后的有效治療手段[4-5]。早在20世紀初，Leyden和Blumenthal就應用腫瘤疫苗進行了特異性免疫治療[6]。隨著20世紀40年代腫瘤特異性抗原(TSA)的發現和眾多免疫檢查點抑制劑的發現，奠定了腫瘤免疫學基礎[7-8]。

腫瘤的免疫療法發展至今已有眾多技術手段，大體可分為過繼免疫細胞療法和抗體靶向治療，以及腫瘤疫苗等[9-12]。其中過繼免疫細胞治療包括CAR-T、CAR-NK、DC治療等[13]?？贵w靶向治療包括PD-1、PD-L1、CTLA4等[14-15]。腫瘤疫苗包括腫瘤全細胞疫苗、DC疫苗、CTL表位疫苗，以及靶向腫瘤新生血管疫苗等。2014年日本和美國FDA先后批準PD-1抗體用于治療晚期黑色素瘤。研究發現腫瘤細胞高表達PD-L1，結合淋巴細胞膜上PD-1后能抑制B細胞和T細胞的增殖，發生腫瘤免疫逃逸[16]。因此，給予PD-1或PD-L1抗體治療，在體內競爭性結合，通過阻斷T細胞的抑制信號，從而達到治療腫瘤的目的[17]。RAW264.7屬小鼠巨噬細胞系，是白血病毒誘導產生的腫瘤細胞，可表達PD-1。本課題旨在研究我科室制備的RAW264.7細胞蛋白和PD-L1抗體對于小鼠黑色素瘤(B16)的抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與動物 B16黑色素瘤細胞由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室楊寒朔教授惠贈，本室保種傳代。小鼠巨噬細胞Raw264.7由四川大學華西醫院公共實驗技術中心提供，本室傳代保種。產PD-L1抗體的雜交瘤細胞株10B5由陳列平教授課題組惠贈。C57BL/6雌性小鼠，清潔級，6～8周,購自四川成都達碩實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK(川)2015-03]。

1.1.2 主要試劑 細胞培養用DMEM高糖培養基和青霉素鏈霉素購自Gibco公司，胎牛血清購自阿根廷Natocor公司，TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司，CD3、CD4和CD8流式抗體均購自BD公司。PD-L1抗體購自NOVUS(NBP1-76769)。

1.2 實驗方法

1.2.1 B16細胞和雜交瘤10B5細胞培養 B16于含有10% FBS，青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM高糖培養基中，37 ℃、5% CO2孵箱內培養。雜交瘤10B5細胞于含有10% FBS，青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的1640培養基中，37 ℃、5% CO2孵箱內培養。

1.2.2 PD-L1抗體制備和驗證 收集雜交瘤細胞培養上清1L，于800 g離心10 min去除細胞碎片沉淀，0.22 μm濾膜過濾，用protein G蛋白純化柱在蛋白純化儀上純化PD-L1抗體。純化后的蛋白抗體用BCA法測定蛋白濃度，同時取少量蛋白抗體加蛋白loading buffer變性后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色鑒定，同時用western blot方法驗證抗體特異性。

1.2.3 Raw264.7細胞蛋白制備 收集傳代培養的Raw264.7細胞，用5 ml RIPA于冰上裂解細胞30 min，4 ℃，15 000 g離心5 min收集蛋白上清，用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.4 C57小鼠腫瘤模型建立 取對數生長的B16細胞，用生理鹽水稀釋成濃度為4×106/ml細胞懸液，每只小鼠背部皮下接種細胞2×105個細胞，用游標卡尺測量皮下腫瘤的長徑和寬徑，待腫瘤平均體積達到100 mm3時，開始給藥治療。

1.2.5 RAW264.7細胞蛋白和PD-L1抗體治療腫瘤小鼠 腫瘤小鼠隨機分成3組，每組10只小鼠，組A為RAW264.7蛋白治療組，劑量為50 μg蛋白/只,一周后以相同劑量再次給藥一次；組B為PD-L1抗體治療組，劑量為600 μg/只，每隔3天給藥1次，共給藥4次；組3為生理鹽水對照組。3組治療方法均為腹腔注射。

1.2.6 荷瘤小鼠脾臟CD3，CD4和CD8流式分析 經過治療的小鼠，在最后1次測量腫瘤體積后脫頸處死，無菌取脾臟研磨，過70 μm篩網，裂解紅細胞，分別在100 μl的FACS buffer中加CD3，CD4，CD8流式抗體染色30 min，離心重懸后立即流式分析。

1.3 統計學分析

應用SPSS 21.0分析數據。小鼠腫瘤體積分析均采用單因素重復測量數據的方差分析；流式數據采用單因素方差分析。P<0.05判定為有統計學差異。

2 結果

2.1 PD-L1抗體和RAW264.7蛋白制備

1l細胞培養上清共純化出8 ml PD-L1抗體,濃度為6.38 mg/ml?？捡R斯亮藍染色顯示，經過變性后的抗體，包括部分未解鏈的全抗體和部分解離成輕鏈和重鏈的抗體片段(圖1)。Western blot顯示純化的PD-L1抗體確實能夠與相應抗原特異性結合產生條帶(圖2)。收集對數生長期RAW264.7細胞，RIPA裂解后提取總蛋白，經WB驗證可與PD-L1特異性結合。

圖1 純化PD-L1抗體考馬斯亮藍染色結果

圖2 RAW264.7細胞蛋白于PD-L1特異性結合western blot結果

2.2 RAW264.7細胞蛋白和PD-L1抗體治療腫瘤小鼠結果

三組荷瘤小鼠接受治療后，每3天測量腫瘤體積大小。結果顯示，生理鹽水對照組(group C)小鼠腫瘤生長最快，PD-L1抗體治療組(group B)次之，RAW264.7蛋白治療組(group A)腫瘤生長速度最慢，具有顯著性差異(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組荷瘤小鼠治療后腫瘤生長情況

2.3 荷瘤小鼠免疫細胞群流式細胞術分析

接種腫瘤后經過蛋白治療12天后，無菌取脾，制成單細胞懸液，流式抗體CD3、CD4、CD8染色分析細胞群落。結果顯示，3組荷瘤小鼠，用PD-L1抗體治療后，淋巴細胞中CD4+T細胞比例比其他兩組的均較低，且具有統計學差異(P<0.05)，RAW264.7蛋白治療組(group A)CD4+和CD8+比例與生理鹽水治療組(group C)相比未見明顯差異，見圖4。

圖4 各組小鼠脾臟免疫細胞群流式細胞術分析

3 討論

自20世紀50年代免疫監視學說被提出以來，免疫檢查點抑制劑包括PD-1、PD-L1、CTLA-4等已成為抗腫瘤領域的治療熱點。程序性死亡受體1(programmed cell death protein,PD-1)是T細胞表面的一類抑制性受體，當與腫瘤表面的配體PD-L1(programmed cell death-1 Ligands)結合時，能誘導T細胞衰竭，抑制T細胞功能，從而發生腫瘤免疫逃逸。因此，針對PD-1或PD-L1的單克隆抗體可阻斷PD-1和PD-L1的結合，從而抑制負調控信號，使T細胞恢復活力[18-19]。本課題組利用雜交瘤細胞系10B5制備大量PD-L1單克隆抗體，并進行純化、驗證。western blot驗證結果顯示，所制備的PD-L1單克隆抗體變性后樣本出現三條帶，包括分子量為130 KD的抗體全長、分子量為55KD的抗體重鏈以及分子量為25KD的抗體輕鏈序列。此外，本課題組通過培養RAW264.7細胞，提取總蛋白，WB結果顯示，該蛋白能與PD-L1特異性結合。

在小鼠接種B16腫瘤細胞后，待腫瘤體積平均達到100 mm3后，3組小鼠分別進行RAW264.7蛋白(組A)、PD-L1抗體(組B)和生理鹽水對照(組C)治療。在治療后，組C小鼠體積增長迅速，在末次測量時平均體積達到4004 mm3，腫瘤生長趨勢已報道的研究結果類似[20]；組B和組C小鼠體積增長緩慢，在給藥后12天小鼠腫瘤平均體積分別為1637 mm3和882 mm3。3組小鼠在治療結束后，分別取脾臟，制備單細胞懸液，流式細胞術分析CD3、CD4、CD8細胞群顯示：給予PD-L1抗體治療后小鼠CD3+CD8+T cell數目顯著增加，達到77.65%(P<0.01)，CD3+CD4+T cell群數目減少，提示機體CD4+T細胞轉化為具有殺傷性的CD8+T細胞；而組A和組C兩組CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞數未見顯著性差異，但兩者CD3+CD8+T細胞數均略高于C57空白小鼠。

腫瘤免疫檢查點抑制劑療法已成為眾多醫藥企業和科研院所的關注重點，我課題組制備的PD-L1抗體和RAW264.7蛋白能分別于體內PD-1和PD-L1競爭性結合，從而抑制T細胞的負調控信號，使之能有效識別并殺傷腫瘤細胞。隨著腫瘤特異性抗原逐漸被發現，更多免疫檢查點必將被揭示，單克隆抗體抑制劑也將在腫瘤免疫治療領域發揮更加重要的作用。