一株新分離的豬流行性腹瀉病毒變異株的評估

方超，張智明，李建華，何世民

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是豬的一種以腹瀉、嘔吐、后期脫水以至死亡為臨床癥狀，由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、高度傳染性腸道疾病。哺乳仔豬的死亡率高是本病的典型特征，死亡率可達到50%～100%，是危害養豬業的一種重要疾病[1-5]。2010年冬季以來，豬流行性腹瀉出現變異株，導致PEDV CV777株疫苗免疫效果不理想，不能對免疫豬提供良好的保護，因此，開發豬流行性腹瀉變異株疫苗有著十分迫切的現實意義[6-10]。

1 材 料

Vero細胞、MDBK細胞和PK-15細胞，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心傳代保存；豬流行性腹瀉ZF株F1代，由哈爾濱獸醫研究所惠贈；DMEM細胞培養液，購自GIBCO公司；胎牛血清，購自CLARK公司；胰酶，購自GIBCO公司；PBS溶液，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心配制保存；中和抗體效價≥1∶32的豬流行性腹瀉陽性血清，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心制備、標定和保存；4～6周齡PEDV血清中和抗體陰性的斷奶仔豬3頭；牛病毒性腹瀉病毒熒光抗體和豬瘟病毒熒光抗體，由哈爾濱獸醫研究所惠贈；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 病毒培養和傳代

2.1.1 細胞的復蘇與傳代

將凍存的Vero細胞從液氮中取出后，立即置于37℃水浴中快速融化。待細胞完全解凍后，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用吸管吸取新配置的細胞培養液，將沉淀輕輕懸起并分散均勻后轉至含有10 mL細胞培養液的細胞培養瓶中，置37℃培養箱中培養36～48 h，觀察細胞的生長情況，根據細胞的生長復蘇狀態，可在復蘇后24 h進行1次換液。待細胞形成單層后棄去培養液，用無菌PBS溶液輕輕清洗細胞表面2次后，加入0.25%的胰酶短暫消化后棄去胰酶，用適量的細胞培養液輕輕吹打分散均勻，然后按照1∶3～1∶5比例進行傳代，置37℃培養箱中培養。

2.1.2 PEDV的接種與收獲

待細胞形成單層后，棄去培養液，用無菌PBS輕輕清洗表面2次后，按照2%的接種比例接種含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的PEDV ZF株，置37℃培養箱中吸附1 h，期間每隔15 min輕輕晃動1次，最后補加含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的無血清DMEM細胞培養液，同時設相同條件的不接毒Vero細胞作為空白對照，置37℃培養箱中培養48～72 h，逐日觀察細胞病變（CPE）情況，待細胞病變達到80%以上時，收獲培養物，-20℃凍融2次后，備用。按照相同的方法將PEDV ZF株從F1代連續繼代15次，各代次病毒在收獲后，均-20℃凍融2次后，備用。

2.1.3 病毒含量的測定

將細胞懸液按每孔100μL的量接入96孔細胞培養板，37℃、5%CO2條件下培養48～72 h，待細胞形成單層后，棄去細胞培養液，備用。將收獲的病毒液用含有終濃度為10μg·mL-1胰酶的無血清DMEM細胞培養液進行10×的倍比稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度，每個稀釋度接種96孔細胞培養板6孔，每孔100μL。同時設正常細胞對照6孔。置37℃、5%CO2培養箱中培養4～5 d，逐日觀察細胞病變。按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。正常細胞對照孔應不產生CPE。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 血清學鑒定

將PEDV病毒液，按照2.1.3病毒含量的測定結果，用含終濃度為10μg·mL-1胰酶的DMEM無血清培養液稀釋成200 TCID50/0.1 mL，分別與等量的豬流行性腹瀉陽性血清、陰性血清混合，置37℃水浴作用1 h后，加入96孔細胞培養板中形成細胞單層的6個孔內，同時設正常細胞對照，置37℃、5%CO2培養箱中培養5 d，觀察細胞是否出現病變。

2.2.2 分子生物學鑒定

引物的設計與合成。參照中華人民共和國國家標準《豬流行性腹瀉病毒RT-PCR診斷技術》（GB/T 34757—2017）中的聚合酶鏈式反應進行引物合成及PCR檢驗，擴增315 bp長的片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物為5"-TAT?GGCTTGCATCACTCTTA-3"，下游引物為5"-TT?GACTGAACGAACCAACACG-3"，按照試劑盒提供的提取核酸的步驟進行操作，將上述提取的核酸進行RT-PCR擴增反應。反轉錄（20μL體系）：模板8.0 mL，通用引物1.0μL，5×Buffer 4.0μL，RNA酶抑制劑1.0μL，DTT 1.0μL，M-MLV 1.0μL，無RNA酶水3.0μL。反轉錄反應條件：將模板與反轉錄通用引物混合，置70℃水浴5 min，冰浴后迅速冷卻，加入反轉錄體系的其他試劑，置42℃反轉錄1 h，然后再95℃終止反應，即得。PCR擴增反應體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，滅菌去離子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min；4℃終止循環。將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在電壓5～10 V·cm-1條件下作用30 min，同時與DL 2000 DNA Marker進行比較，即可得出試驗結果。

2.3 病毒的純凈性檢測

根據《中國獸藥典》（2015版，三部）的規定，疫苗的制備過程中需要對毒種的純凈性進行檢驗。檢測的外源病毒主要包括牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖于呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒Ⅰ型（PCV-1）和Ⅱ型（PCV-2），其中BVDV、CSFV采用中國獸醫藥品監察所提供的間接免疫熒光法（IFA）進行檢測，其余4種病毒使用PCR或RT-PCR方法進行檢測。

2.3.1 間接免疫熒光法檢測

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，用豬流行性腹瀉陽性血清中和后，分別接種已經形成單層的MDBK細胞和PK15細胞，37℃培養至少14 d（中間應至少傳代1次），并設相應的細胞作為空白對照和BVDV陽性、CSFV陽性對照。最后一次傳代的細胞單層培養5 d左右，按照BVDV、CSFV熒光抗體檢測說明進行熒光抗體檢查。

2.3.2 PCR或RT-PCR法檢測

取2.2.2中提取的核酸進行PCR或RT-PCR檢測。參照中華人民共和國國家標準《偽狂犬病診斷技術》（GB/T 18641—2002）中的聚合酶鏈式反應進行引物合成及PCR檢驗，擴增217 bp長的片段，上游引物為5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，下游引物為5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，退火溫度56℃；參照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準《豬細小病毒病聚合酶鏈反應操作規程》（SN/T 1874—2007）中的聚合酶鏈式反應進行引物合成及PCR檢驗，擴增445 bp長的片段，上游引物為5"-CAGAATCAGCAACCTCAC-3"，下游引物為5"-TG?GTCTCTTCTGTGGTAGG-3"，退火溫度為47.9℃；參照中華人民共和國國家標準《豬繁殖和呼吸綜合征診斷方法》（GB/T 18090—2008）中的聚合酶鏈式反應進行引物合成及PCR檢驗，擴增372 bp長的片段，上游引物為5"-GCGGATCCATGCCAAATAA?CAAC-3"，下游引物為5"-AGCTCGAGTCATGCT?GAGGGTGA-3"，退火溫度51℃；參照中華人民共和國國家標準《豬圓環病毒聚合酶鏈反應試驗方法》（GB/T 21674—2008）中的聚合酶鏈式反應進行引物合成及PCR檢驗，PCV-1型652 bp，PCV-2型1 154 bp長的片段，P1 5"-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3"，P2 5"-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3"，P3 5"-ACCCCCGCCACCGCTACC-3"，退火溫度62℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 無菌檢驗與支原體檢驗

根據《中國獸藥典》對病毒液進行無菌檢驗和支原體檢驗。

2.5 病毒的遺傳穩定性測定

在疫苗的制備過程中，病毒的遺傳穩定性非常重要，因此對PEDV進行了遺傳穩定性檢測。取2.1.2中連續培養傳代的PEDV ZF株F6代、F11代和F16代病毒液，按照2.2.2中所述的核酸提取以及反轉錄方法進行核酸提取和反轉錄，對反轉錄的cDNA進行病毒的遺傳穩定性分析。由于PEDV S蛋白是重要的免疫原性蛋白，因此選擇S基因的部分序列進行。參照李衡[11]的研究結果合成擴增PEDV S部分基因的引物，上游引物為5"-GGTAAGTTGCTAGTGCG?TAA-3"，下游引物為5"-CAGGGTCATCACAATA?AAGAA-3"，目的片段大小為1 461 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增反應體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，滅菌去離子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min；4℃終止循環。將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在電壓5～10 V·cm-1條件下作用30 min，在凝膠成像系統下觀察并切割目的片段，直接送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序的結果用DNA Stars軟件進行分析。

2.6 病毒致病力的測定

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，根據病毒含量測定的結果稀釋到1×106.0TCID50·mL-1，備用，進行病毒致病力的測定。用4～6周齡的PEDV血清抗體陰性的斷奶仔豬2頭，每頭豬經口服2.0 mL備好的PEDV病毒液。同時另設1頭豬作為不接毒空白對照，相同條件隔離飼養。試驗開始后觀察14 d，每天就試驗豬的精神狀態、采食量、腹瀉情況、死亡等臨床癥狀進行觀察和記錄。

3 結果與分析

3.1 病毒培養和傳代的結果

PEDV ZF株接種Vero細胞后，在24 h左右Vero細胞出現膨大、變圓等輕微的細胞病變，隨著接毒時間的延長，病變逐漸明顯，表現為細胞變圓、膨大、出現空泡以及細胞脫落，最終使得細胞單層裂解。待細胞病變達到80%及以上時，收獲培養物；相同條件培養的對照細胞僅出現細胞顆粒增多等細胞老化的現象，結果見圖1。

3.2 病毒含量的測定結果

將PEDV ZF株F1代在Vero細胞上連續傳代15次，每個代次均進行病毒含量的測定，測定結果見表1。由表1可知，PEDV ZF株在連續傳代的過程中，對細胞的適應性穩定，各個代次的病毒含量無明顯差異。

圖1 PEDV的細胞培養結果

表1 PEDV ZF株不同培養代次病毒含量測定結果

3.3 病毒鑒定

3.3.1 病毒的血清學鑒定結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，進行病毒的血清學鑒定。結果表明該代次PEDV ZF株可被豬流行性腹瀉病毒陽性血清完全中和，接種的Vero細胞觀察5 d不產生細胞病變，病毒特異，結果見表2。

表2 血清學鑒定結果

3.3.2 病毒的RT-PCR鑒定結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，進行PEDV的RT-PCR法鑒定，結果見圖2。結果表明PCR能擴增出片段大小為315 bp左右的條帶，與引物設計擴增目的條帶的大小一致。

3.4 病毒的純凈性鑒定結果

3.4.1 間接免疫熒光法檢測結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液，用豬流行性腹瀉陽性血清中和后，分別接種已經形成單層的MDBK細胞和PK15細胞，進行外源病毒BVDV和CSFV的檢測。結果表明，PEDV病毒液中BVDV、CSFV兩種外源病毒檢測結果均為陰性，結果見圖3和圖4。

圖2 PEDV RT-PCR鑒定結果

圖3 BVDV間接免疫熒光檢測結果

圖4 CSFV間接免疫熒光檢測結果

3.4.2 PCR或RT-PCR法檢測結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液提取的核酸，進行病毒液中PRV、PPV、PRRSV和PCV的PCR或RT-PCR檢測。結果表明，在PEDV病毒液中，PRV、PPV、PRRSV和PCV的檢測結果均為陰性，結果見圖5。

圖5 PEDV外源病毒檢測結果

3.5 PEDV病毒液無菌檢驗及支原體檢驗結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液按照《中國獸藥典》要求進行無菌檢驗及支原體檢驗。結果見表3和表4。結果表明PEDV病毒液沒有被細菌、霉菌、支原體等污染。

3.6 病毒的遺傳穩定性測定結果

分別取PEDV ZF株培養收獲的F6代、F11代和F16代病毒液，進行PEDV S蛋白部分基因的擴增，結果見圖6。

表3 無菌檢驗結果

表4 支原體檢驗結果

圖6 PEDV S蛋白部分基因的擴增結果

將擴增的片段經膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果用DNA Star軟件包MegAlign的Clustal W進行比對，結果PEDV ZF株F6代、F11代和F16代的S蛋白部分基因的同源性在99.8%以上，病毒的遺傳穩定性良好。結果見圖7。

圖7 PEDV ZF株不同代次S蛋白部分基因序列比對結果

3.7 病毒致病力的測定結果

取最后一次傳代收獲的PEDV病毒液對4～6周齡的PEDV血清抗體陰性的斷奶仔豬進行攻毒，進行病毒致病力的測定，并在攻讀后每天對試驗豬的精神狀態、采食量、腹瀉情況、死亡等臨床癥狀進行觀察和記錄。結果攻毒的2頭豬在24 h后出現輕微的腹瀉、精神不振以及食欲減退等癥狀。隨著時間的延長，攻毒的2頭豬臨床癥狀加重，出現水樣腹瀉、肛門及后肢糞便污染嚴重、四肢無力、站立不穩以及被毛粗糙、沒有光澤等癥狀，7 d內有1頭豬出現死亡，對死亡豬進行解剖，發現腸壁變薄、變透亮、出血，腸道內充滿氣體并含大量黃色內容物，見圖8。未攻毒對照仔豬食欲正常，精神狀態良好。

圖8 攻毒豬剖檢結果

4 結論

為了能更好地應對由PEDV變異株感染引起的豬流行性腹瀉，本試驗對已經分離鑒定的PEDV變異株進行細胞適應性、病毒含量、純凈性、遺傳穩定性及致病力的檢驗，證明該毒株的細胞適應性好、病毒含量高、病毒純凈、遺傳穩定以及致病力良好，可以作為制備預防PEDV變異株滅活疫苗的候選疫苗株，為后期疫苗的制備做好鋪墊。