沉默S100A10基因對卵巢癌SKOV-3和A2780細胞周期的影響

顏 偉 陳潭琇 王雅琦 王靈芝

據統計，全球每年有20～22萬人被診斷為卵巢癌，死亡人數每年10～14萬人[1]。盡管卵巢癌可采用手術切除、化療和放療等治療手段，但預后依然較差，其中最主要的原因是卵巢癌發病隱匿，臨床癥狀體征不典型，被發現時大部分患者已處晚期[2]。與其他腫瘤類似，卵巢癌的發病機制十分復雜，它的發生發展涉及腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成及趨化等[3]。S100A10屬于S100蛋白家族成員之一，有研究表明S100A10在多種腫瘤(包括乳腺癌，肺癌，胃癌，胰腺癌及結直腸癌等)中異常高表達，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥、血管生成以及遷移侵襲的調控。然而，S100A10在卵巢癌中的作用目前報道較少[4]。本研究擬改變S100A10在卵巢癌細胞中的表達，通過體外實驗檢測S100A10對卵巢癌細胞周期的影響，探討S100A10在卵巢癌中的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

山羊抗兔/小鼠的單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白定量試劑盒及化學發光液購自美國Thermofisher公司；S100A10單克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司，cyclinD1、CDK2及CDK4單克隆抗體購自Cell Signaling公司，β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；SKOV-3、A2780及HEK293T細胞購自ATCC細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 S100A10-shRNA的合成 S100A10-shRNA序列及對照序列shGFP均由上海生物工程股份有限公司合成，分別命名為shS100A10#1、shS100A10#2、shGFP。

1.2.2 細胞培養與轉染 用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養HEK293T細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養SKOV-3和A2780細胞,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養。待HEK293T細胞達到70%～80%滿后，將合成的shGFP、shS100A10#1和shS100A10#2按照脂質體試劑說明操作經Lipofectamine2000轉入細胞中，48 h后，收集培養上清病毒液，800 g離心10 min，用0.45 μm濾器過濾，-80 ℃保存。將過濾后的病毒上清以1∶3的體積比加入SKOV-3和A2780細胞培養上清中，另外加入5 mg/ml的polybrene，轉染后細胞分別命名為shGFP組、shS100A10#1組、shS100A10#2組。

1.2.3 細胞周期實驗 用胰蛋白酶進行消化，收集細胞，棄上清，用70%預冷乙醇固定，用PI在4 ℃染色30 min,最后采用流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復3次。

1.2.4 Western Blot實驗 收集細胞，用細胞裂解液(1% Triton X-100;10 mM Tris-HCl,pH 7.4;150 mM NaCl;0.25% 去氧膽酸鈉;5 mM EDTA,pH 7.4)于冰上裂解20～30 min后，12 000 rpm離心15 min，收集蛋白上清，用BCA試劑盒測蛋白濃度，取等量蛋白15 μg進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃一抗(1∶5000)或β-actin(1∶4000)抗體孵育過夜，TBS-T洗3次，室溫二抗(1∶5000)孵育1 h，化學發光顯影，最后曝光成像。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件分析，計量資料采用t檢驗。若P<0.05，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S100A10基因沉默的SKOV-3細胞和A2780細胞系的建立及鑒定結果

本研究成功構建穩定的S100A10基因敲降的SKOV-3和A2780細胞系。為檢測轉染效率，采用Western Blot法檢測S100A10的蛋白表達水平，結果顯示轉染組(shS100A10#1、shS100A10#2轉染)SKOV-3和A2780細胞中S100A10蛋白的表達強度均明顯低于各自對照組(shGFP轉染)SKOV-3和A2780細胞。見圖1。該結果說明shRNA質粒構建有效，可以進行后續實驗。

圖1 S100A10敲降卵巢癌細胞S100A10蛋白表達水平

2.2 S100A10敲降后SKOV-3和A2780細胞增殖能力變化

為了檢測S100A10表達水平對卵巢癌細胞增殖的影響，研究采用CCK8法檢測細胞增殖。實驗結果表明，S100A10表達下調，細胞增殖能力明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 S100A10敲降對卵巢癌細胞增殖能力的影響

2.3 S100A10敲降后對卵巢癌細胞周期的影響

為了檢測S100A10表達水平對卵巢癌細胞周期的影響，本研究采用流式細胞術檢測細胞周期變化。實驗結果表明，抑制S100A10的表達后，SKOV-3細胞周期阻滯在G0/G1期，S期細胞數減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 沉默S100A10表達水平對SKOV-3細胞周期的影響

2.4 S100A10敲降后SKOV-3和A2780細胞CyclinD1、CDK2及CDK4表達水平變化

CyclinD1、CDK2及CDK4是目前比較公認的可影響細胞周期的蛋白分子，在細胞從G1期進入S期過程中起著至關重要的作用。為了進一步確認S100A10可以影響卵巢癌細胞周期，采用Western Blot法檢測，結果發現S100A10敲降后，轉染組(shS100A10#1、shS100A10#2轉染)SKOV-3和A2780細胞CyclinD1、CDK2及CDK4表達水平明顯低于對照組(shGFP轉染)，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。該結果說明S100A10敲降通過抑制CyclinD1、CDK2及CDK4蛋白的表達從而將細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。

圖4 S100A10敲降后卵巢癌細胞周期相關蛋白表達水平的變化

3 結果

卵巢癌在女性常見腫瘤中發病率居第九位，病死率居第五位，嚴重影響女性健康。在我國，卵巢癌的發病率呈逐年上升趨勢，目前盡管外科手術切除、化療和放療已被證實有較好療效，但卵巢癌發現時大部分處于進展期或者已發生轉移。近二十年來，在提高卵巢癌患者生存期方面沒有實質的進展，預后依然較差[5]。因此，闡明參與卵巢癌進展的分子機制是臨床亟需解決的重要難題。

S100A10屬于S100家族成員之一，與其他20種已知的S100蛋白家族分子不同的是，S100A10一直處于活性狀態且對胞內Ca2+信號不敏感[6-7]。S100A10在胞質中可與Annexin A2相互作用形成異源復合體，從而使其從胞質轉運至細胞膜。目前，研究表明S100A10在多種細胞類型中表達，包括內皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞以及多種腫瘤細胞，它被認為是癌基因，有多項研究探討S100A10表達水平與腫瘤發生發展的關系[8]。

癌細胞增殖能力增強是癌癥進展的主要原因之一，Ken Katono等報道S100A10在肺腺癌中高表達，且S100A10表達水平與預后相關。S100A10在球面鱗狀細胞癌中呈高表達，參與邊緣上皮細胞增殖和分化[9]。miR-590-5P過表達能夠有效降低S100A10的表達，從而抑制HepG2細胞增殖[10]。在本研究中，我們通過敲降SKOV-3和A2780細胞中S100A10的表達水平，以此檢測S100A10對SKOV-3和A2780細胞增殖的影響，結果發現S100A10敲降后，SKOV-3和A2780細胞的增殖能力明顯減弱，且細胞周期阻滯在G0/G1期。這與目前在其他腫瘤中的研究結果相似，由此提示S100A10在卵巢癌中可能是癌基因。

CyclinD1、CDK2及CDK4是影響細胞周期相關蛋白分子，在細胞從G1期進入S期過程中起著非常重要的作用[11]。本研究在改變了S100A10表達的SKOV-3和A2780細胞中應用了Western Blot法檢測了CyclinD1、CDK2及CDK4的表達水平，結果證明S100A10的表達與CyclinD1、CDK2及CDK4的表達水平一致，這與細胞周期實驗檢測結果相一致，同時也證明了S100A10在卵巢癌中是一個癌基因。

綜上所述，課題組通過細胞功能學實驗，發現S100A10敲降抑制SKOV-3和A2780細胞增殖并阻滯SKOV-3細胞處于G0/G1期，細胞周期相關蛋白CDK2、CDK4及CyclinD1表達下調，從而抑制卵巢癌細胞進入G2/M期，使其無法啟動有絲分裂，因此抑制了細胞增殖。本實驗初步揭示了S100A10表達水平對卵巢癌細胞增殖具有調節作用，為尋找卵巢癌臨床治療靶點提供了新思路。