miR-516b-5p靶向ATM調控鼻咽癌細胞HONE1 DNA修復的機制研究

張 勇 張 煒 范崇盛

DNA雙鏈斷裂(DSB)是DNA損傷的最危險形式，因為無法修復它們可能導致細胞死亡，基因組不穩定或腫瘤發生[1]。真核細胞中有兩種主要的DSB修復途徑，即非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)[2]。DSB還激活了1個復雜的信號網絡，稱為DNA損傷響應(DDR)，它協調DSB的修復和細胞周期檢查點的激活[3]。腫瘤是1種具有無限增殖能力的細胞組織[4]。DNA損傷及其修復機制是導致腫瘤形成的重要因素[5]。基于此，本研究使用鼻咽癌細胞HONE1為研究對象，旨在探討鼻咽癌細胞HONE1中抑制DNA修復的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

pBABE-dd-I-PpoI購自addgene公司(貨號：49052)。他莫昔芬購自sigma公司(貨號：T5648-1G)。pDNA-PKcs抗體購自abcam公司(貨號：ab32566)。GAPDH抗體購自上海機純實業有限公司(貨號：ml4041550(s))。ATM抗體購自廣州市左克生物科技發展有限公司(貨號：BF0374-100ul)。鼻咽癌細胞HONE1購自廣州一駿生物制品有限公司(貨號：JNO-1861-2)。miRNA mimics,miRNA inhibitor,siRNA和ATM過表達質粒均由上海權陽生物提供。Etoposide(ETP)購自深圳市益百順科技有限公司(貨號：Etoposide)。Shield-1購自上海皓元生物醫藥科技有限公司(貨號：HY-112210)。熒光素酶報告質粒pEZX-MT01購自復能基因(貨號：CmiT000001-MT05)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 鼻咽癌細胞HONE1在含有10%胎牛血清的DMEM中培養細胞。miRNA mimics,miRNA inhibitor,siRNA和ATM過表達質粒與轉染試劑混合，在室溫下靜止20 min后，緩緩滴入鼻咽癌細胞HONE1中。使用500 nM Etp,處理鼻咽癌細胞HONE1 48 h。

1.2.2 免疫印跡 用PBS洗滌一次后，將細胞重懸于預冷的RIPA緩沖液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4、1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，1%Triton-X-100、0.1%萘二酚，0.1%SDS，150 mM NaCl，蛋白酶抑制劑(完全不含Mini EDTA，#4,693,159,001，Roche)和磷酸酶抑制劑，然后超聲處理，以14,000 rpm的轉速在4離心10 min除去細胞碎片收集上清液，并通過Bradford蛋白質測定法定量蛋白質濃度，將等量的蛋白質上樣至SDS-PAGE或Criterion 4%～12%預制凝膠上。電泳時，將蛋白質在4 ℃下轉移到硝酸纖維素膜上90 min，然后在室溫下將膜與5%脫脂牛奶孵育1 h，然后在4倍于稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，然后在5%脫脂牛奶中與二抗一起孵育室溫下放置1 h。使用蛋白質簡單分析儀，使用增強的化學發光(ECL)Western印跡底物進行檢測。

1.2.3 RNA抽取與實時熒光定量PCR 用于檢測DNA水平的引物序列如下：(SLCO5a1-F-cut：CCCAGTGCTCTGAATGTCAA； SLCO5a1-R-cut：CCATTCATGCGCGTCACTA)。使用GAPDH(GAPDH-F：TCAGCCAGTCCCAGCCCAAG;GAPDH-R：GAGAAAGTAGGGCCCGGCTAC)引物對將DNA水平標準化為實時PCR值。

1.2.4 高通量測序 通過trizol法抽取ETP誘導DNA損傷后的鼻咽癌細胞HONE1總RNA。RNA樣品被送到北京基因組研究所進行商業性RNA-Seq服務和數據分析。使用SOAPaligner/SOAP2不匹配，將明確的讀段映射到human數據庫。計算每個基因讀數，然后將其標準化為每百萬分之一讀數(kbKM)，該讀數與基因表達水平相關。利用log2比率來確定基因調控。選擇log2比率為-1或log2比率為1的學差異基因進行進一步分析。

1.2.5 基于I-PpoI的可誘導DSB系統 將pBABE-dd-I-PpoI質粒轉染至鼻咽癌細胞HONE1中，使用嘌呤霉素篩選穩定細胞株。為了進行DNA切割和修復分析，將Shield-1的以終濃度1 mM添加到細胞中3 h，以穩定dd-I-PpoI，然后再與4 mM 4-OHT一起孵育30 min。 處理后，將藥物在PBS中沖洗掉，以便隨時間推移進行DNA修復。通過實時PCR進一步定量I-PpoI位點的DNA水平。通過實時PCR分析富集的染色質。引物序列(SLCO5a1F-F：GCATGAATGGATGAACGAGAT；用于實時PCR的SLCO5a1R-F：CAAGCTCAACAGGGTCTTCT)位于200 b.p.的5'上游區域的兩側、切割部位的遠端。斷裂期間的實時PCR分析用于測量I-PpoI位點的完整性，并將每個樣品中的值均以GAPDH標準化。繪制3個獨立實驗的平均值和SEM。將非同源末端連接因子占用率和每個時間點的輸入值歸一化為GAPDH。所有數據均以未處理樣品的值標準化為1。

1.2.6 熒光素酶報告實驗 熒光素酶報告質粒pEZX-MT01包含AMT的野生型或突變型3'UTR。使用熒光素酶報告基因系統分析熒光素酶活性前，將miRNA mimic或陰性對照(NC)和熒光素酶報告基因共轉染至鼻咽癌細胞HONE1(1×104)48 h。

1.3 統計學分析

每個實驗至少重復3次，結果顯示為平均值±標準差(SD)。使用SPSS 19.0進行統計分析。進行雙尾t檢驗以比較組之間的差異。P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 ETP誘導鼻咽癌細胞HONE1 DNA損傷的miRNA表達譜

使用ETP處理鼻咽癌細胞HONE1造成DNA損傷后，通過高通量測序發現ETP處理后hsa-miR-9983-3p,hsa-miR-4731-5p,hsa-miR-3675-5p,hsa-miR-516b-5p,hsa-miR-4437,hsa-miR-7114-5p,hsa-miR-637,hsa-miR-5008-5p的表達水平上升至少8倍。

2.2 miR-516b-5p導致DSB的DNA-PKcs含量減少

可誘導的I-PpoI核酸內切酶系統可在人類基因組中的已知位置切割[6]。他莫昔芬處理并加入Shield-1使鼻咽癌細胞HONE1中的酶穩定，從而誘導了與ER核定位序列融合的I-PpoI核酸內切酶的核定位[7]。通過洗掉他莫昔芬和Shield-1使I-PpoI不穩定并輸出到細胞質中，從而使修復得以實現[8]。使用此系統對人類SLCO5A基因中I-PpoI位點的定量PCR分析后發現miR-516b-5p mimics導致DSB的DNA-PKcs含量減少(P<0.05)，而miR-516b-5p inhibitor導致DSB的DNA-PKcs含量增加(P<0.05)，見圖1A和圖1B。

圖1 miR-516b-5p導致DSB的DNA-PKcs含量減少

2.3 miR-516b-5p靶向ATM抑制DNA-PKcs磷酸化水平

通過miRDB在線分析發現miR-516b-5p潛在靶向多種基因。在鼻咽癌細胞HONE1中過表達miR-516b-5p后，發現ATM mRNA的表達水平和蛋白表達水平下降，DNA-PKcs的磷酸化水平下降；而敲低表達miR-516b-5p后，發現ATM mRNA的表達水平和蛋白表達水平上升，DNA-PKcs的磷酸化水平上升。同時，miR-516b-5p靶向ATM的3端非編碼區報告基因活性下降。過表達ATM后，DSB的DNA-PKcs含量上升(P<0.05)，而敲低ATM后，DSB的DNA-PKcs含量下降(P<0.05),見圖2。

圖2 miR-516b-5p靶向ATM抑制DNA-PKcs磷酸化水平

3 討論

DNA的完整性對于維持基因組的穩定性至關重要，而這對于所有生物的生存和正常運行至關重要[9]。使用DNA作為基于堿基配對的DNA復制的模板是1個嚴格而精確的事件[10]。但是，DNA容易受到多種因素造成的破壞，例如來自環境或體內的化學致癌物，正常代謝產生的氧化性自由基，端粒縮短，端粒酶活性變化，原癌基因激活，腫瘤抑制基因失活，紫外線(UV)輻射和電離輻射以及許多藥品，尤其是遺傳毒性抗癌藥[11]。自發性損害和環境損害均可導致DNA分子的損壞，包括DNA雙鏈斷裂(DSB)[12-13]。

在正常細胞中，大多數DNA損傷可以通過觸發眾多復雜而精確的調節機制來修復，包括激活細胞周期檢查點，啟動修復系統以及誘導細胞凋亡[14]。腫瘤是1種具有無限增殖能力的細胞組織，DNA損傷及其修復機制是導致腫瘤形成的重要因素[15]。在癌前病變中，經常會檢測到由損傷激活的DNA損傷和DNA損傷修復途徑，其中包括ATM，Chk1，Chk2，H2AX，p53和p16等檢查點激酶的激活以及DNA標記灶的形成[16]。本研究通過ETP誘導HONE1細胞發生DNA損傷后，發現hsa-miR-9983-3p,hsa-miR-4731-5p,hsa-miR-3675-5p,hsa-miR-516b-5p,hsa-miR-4437,hsa-miR-7114-5p,hsa-miR-637,hsa-miR-5008-5p的表達水平上升至少8倍。盡管僅僅檢測到hsa-miR-516b-5p能夠抑制DSB中DNA-PKcs的含量，但是其他miRNA是否參與DSB修復的其他功能仍然值得進一步探索。

在本研究中，過表達miR-516b-5p后，ATM mRNA的表達水平和蛋白表達水平下降，DNA-PKcs的磷酸化水平下降；而敲低表達miR-516b-5p后，ATM mRNA的表達水平和蛋白表達水平上升，DNA-PKcs的磷酸化水平上升。過表達ATM后，DSB的DNA-PKcs含量上升(P<0.05)，而敲低ATM后，DSB的DNA-PKcs含量下降(P<0.05)。ATM和DNA-PKcs是磷酸肌醇3激酶樣(PIKKs)絲氨酸/蘇氨酸激酶[17]。DNA-PKcs和ATM在響應DNA DSB和協調DSB修復的早期就被激活[18]。DNA-PKcs被Ku70和Ku80異二聚體募集并在DSB處激活[19]。 Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)復合體在DSB募集并激活了ATM[20]。激活后，ATM在細胞周期的G1期促進NHEJ，而在S/G2促進HR[21]。相反，DNA-PKcs主要在NHEJ的DSB修復中起作用[22]。ATM介導的DNA-PKcs磷酸化，從DNA末端取代了DNA-PKcs，而DNA-PKcs介導的ATM磷酸化抑制了ATM的催化活性[23]。提示ATM和DNA-PKcs能夠被募集到相同的DNA末端，它們在彼此之間進行調節。

綜上所述，miR-516b-5p通過靶向ATM mRNA的3端非編碼區，降解了ATM mRNA，抑制了ATM的翻譯，隨后DNA-PKcs的磷酸化水平下降，DNA-PKcs與DSB的結合減少，最終抑制了鼻咽癌細胞HONE1的DNA修復。