新生兒先天性無痛無汗癥1例NTRK1基因突變家系分子遺傳學分析和隨訪

余慕雪 潘思年 馮嘉麗 李 姝 胡藝馨

1.中山大學附屬第一醫院兒科，廣東廣州 510080；2.中山大學附屬第三醫院兒科，廣東廣州 510630

先天性無痛無汗癥（congenital insensitivity to pain with anhidrosis，CIPA）又稱為遺傳性感覺和自主神經障礙Ⅳ型（hereditary sensory and autonomic neuropathyⅣ，HSAN Ⅳ），是一種罕見的常染色體隱形遺傳性疾病。1932年Dearbom 等[1]首次報道，命名為先天性無痛癥（congenital pure analgesia）。1963年Swanson[2]正式命名為CIPA。1996年Indo 等[3]首次在3例CIPA患者中發現神經營養酪氨酸激酶受體1型（neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1，NTRKl）基因突變。CIPA以對疼痛不敏感、無汗和神經精神發育遲緩為特點[4]。近年新生兒期發病CIPA 陸續報道，多以發熱起病[5-7]，但是隨訪報道不多。本研究對1例新生兒CIPA 家系進行分子遺傳學分析和隨訪，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

先證者，男，2018年2月在中山大學附屬第一醫院出生。第1孕第1產，胎齡40+3周，因頭盆比例不稱剖宮產分娩出生，Apgar評分1 min 6分、5 min 9分、10 min 9分。因出生時輕度窒息入住新生兒科。其父母親非近親結婚，母親34歲。入院體格檢查：體重3.13 kg，身長49.0 cm，頭圍34.0 cm，頭發分條清楚，皮膚有少量毳毛，指甲和趾甲超指趾端，雙肺呼吸音清，心率120次/min，心音有力，四肢肌張力稍低下。出生12 h 出現發熱，體溫38.5℃，無伴出汗。此后體溫波動于36～41℃之間，予物理治療體溫可以下降，間隔6～72 h 體溫又上升。住院期間取外周血行細菌培養、厭氧菌培養、C-反應蛋白、降鈣素原、巨細胞病毒DNA、人單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型DNA、肺炎支原體DNA、曲霉菌抗原、新型隱球菌抗原等感染指標檢查均正常；免疫學指標類風濕因子、抗核抗體ANA、抗雙鏈DNA 抗體、補體C3、補體C4 等無異常；腦脊液檢查亦無異常發現；行眼科檢查和聽性腦干反應檢查無異常。住院期間予抗生素、抗真菌藥物等治療，仍反復發熱；并發現靜脈抽血時無哭鬧。出生25 d 行基因測序檢測后出院。出院后定期隨訪。體格生長指標按照均值離差法參照世界衛生組織2006年兒童生長標準[8]進行評價。

1.2 基因測序方法

1.2.1 基因組DNA 提取 征得先證者父母知情同意后，抽取先證者和其父母外周血各2 mL，經乙二胺四乙酸抗凝，血DNA用QIAamp血DNA微型試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）提取DNA。

1.2.2 二代測序對候選基因測序 測序由廣州金域醫學檢驗中心有限公司完成。TruSight One Sequencing Panel 根據人類基因突變數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫、GeneTests 網站（www.genetests.org）、Illumina等公司的其他商業化試劑盒的信息，最終納入臨床相關的基因。48個基因（AIRE、ARHGAP31、ATM、AX IN2、CTC1、DKC1、DOCK6、DSP、EDA、EDA2R、EDAR、EDARADD、EVC、EVC2、GJA1、GJB6、GRHL2、IFT122、IFT43、IKBKG、KRAS、KRT14、KRT16、KRT17、KRT6A、KRT6B、KRT74、KRT85、NFKBIA、NHP2、NOP10、NOTCH1、NTRK1、PDGFRA、PKP1、PMS2、PORCN、TERC、TERT、TINF2、TP53、TP63、TRAF6、USB1、WDR19、WDR35、WNT 10A、WRAP53）作為候選基因。提取的DNA 采用DNA酶片段化后用磁珠法進行純化，隨后進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增并連接上接頭序列，經TruSight One Sequencing Panel（Illumina Inc，USA）2次捕獲及純化，再經PCR 擴增和純化后獲得的最終文庫在NextSeq500測序儀（Illumina Inc，USA）對獲選基因的外顯子及鄰近序列進行測序。所有數據用BWA 算法比對到參考序列（UCSC hg19），采用儀器默認設置[9]，使用文獻報道方法[10]對數據進行注釋。根據篩選流程[11]對數據進行篩選，并結合先證者臨床資料和生物信息學軟件（PolyPhen2、LRT、Mutation Taster 等）預測結果，對各個基因的功能、變異情況以及遺傳模式進行分析，得到可疑候選突變。

1.2.3 Sanger 測序驗證 對可疑候選突變的位點設計PCR 引物進行擴增及進行Sanger 測序驗證，并對先證者父母相應位點進行檢測。致病性突變根據美國醫學遺傳學與基因組學會（ACMG）指南[12]判讀。

2 結果

2.1 測序結果

先證者NTRK1基因外顯子5 上的c.447_450 dupTCTG（p.His151fs）和內含子2 上的c.287+2dupT復合雜合突變；先證者父親NTRK1基因外顯子5 上的c.447_450dupTCTG （p.His151fs）雜合突變；先證者母親NTRK1基因內含子2 上的c.287+2dupT 雜合突變。見圖1（封四）。c.447_450dupTCTG（p.His151fs）變異為移碼突變，所編碼的蛋白質自151位氨基酸殘基His 開始發生紊亂，并導致翻譯提前終止，該變異預計會導致所編碼的蛋白質發生截短從而喪失其正常功能。c.287+2dupT 變異為內含子區的重復變異，預計可能引起剪接位點改變，經生物信息學軟件初步分析，改變異可影響mRNA 剪接。

2.2 臨床隨訪

先證者出院后反復發熱，體溫波動38～40℃之間，空調降低周圍環境溫度，體溫可以降至37℃左右；7月齡會抬頭，24月齡可扶坐，隨訪至28月齡時抬頭不穩、不能獨坐、不能站立、不會雙手主動抓物。6月齡咿呀作聲，隨訪至28月齡不能說出單詞、不能重復大人所簡單的音節、聽不懂自己的名字。乳牙10月齡開始萌出，喜咬手指并咬破手指皮膚；12月齡時2 只下正中切牙松弛脫落；28月齡時乳牙18 只、排列紊亂。6月齡前母乳喂養；6月齡后逐漸添加米糊、肉末、果泥等半固體食物；12月齡后進食飯、肉等固體食物，先證者簡單咀嚼固體食物即吞咽。8月齡時碘發汗試驗檢查陰性。

先證者出生時體重、身長和頭圍均位于-2SD～-1SD之間，之后體格指標增長逐漸下降。3～28月齡時體重和身長位于-3SD～-2SD之間，3～12月齡時頭圍位于-3SD～-2SD之間，13～28月齡時頭圍位于-3SD以下。

圖1 先證者及其父母NTRK1基因（見內文第24頁）

3 討論

CIPA是NTRKl 基因突變所致。NTRK1基因位于染色體1q21-q22，由17個外顯子組成，全長25 kb，編碼酪氨酸激酶受體A（tyrosine receptor kinase A，Trk A）。TrkA 蛋白由796個氨基酸編碼，主要在神經元組織中表達，對神經生長因子（nerve growth factor，NGF）具有高親和力[13]。當NGF 與TrkA 結合，啟動神經元存活的信號傳導，且TrkA 磷酸化可以啟動一系列不同的信號激活各種細胞內信號轉導通路，這些通路通過感覺軸突和交感軸突介導皮膚的神經支配[14-15]。當NTRK1基因突變，缺乏對NGF的信號轉導，導致依賴NGF的神經元在發育過程中發生凋亡，使機體產生病變[13]。

本研究先證者反復發熱、無痛、無汗的臨床表現，結合基因測序結果以確診。二代測序的應用，近年新生兒期發病CIPA 病例陸續報道，臨床表現為感覺障礙、發熱、無汗、皮膚干燥、外傷及感染、智力障礙、自殘、骨折及關節病變、視神經萎縮、抽搐等[5]。本例新生兒期發病CIPA 隨訪過程還發現有乳牙早脫落、體格生長遲緩、頭小等表現。目前文獻有2例報道CIPA患兒體格生長遲緩、頭小表現，但未作NTRK1基因檢測：其中Kim 等[16]報道1例出生1周后反復發熱，之后出現自殘行為（咬舌頭、咬手指）、精神發育遲緩、乳牙早脫落的男患兒，16月齡時臨床診斷為CIPA時發現體重和身長低下、頭小；此外Nolano 等[17]報道1例20月齡時發現體重和身長低下、頭小、精神發育遲緩的女患兒，2歲時有自殘（咬手指）、骨折、多發傷等表現，10歲時臨床診斷為CIPA。Gao 等[18-19]進行CIPA患兒的牙齒研究：Gao 等[18]報道1例6歲男性患兒對疼痛不敏感及多顆乳牙和恒牙的脫落而就診，發現牙齒的超微結構和形態計量學研究顯示礦化不足、牙本質發育不全、牙骨質形成缺陷和牙周膜發育異常，NTRK1 雜合突變（c.1561T.C 和c.2057G.A），提出了CIPA患兒牙齒過早脫落不僅與自殘行為有關，還可能與NTRK1 突變引起的發育缺陷有關；Xue 等[19]報道1例7月齡以咬舌頭和手指發病的CIPA 男性患兒，7歲時發現恒牙缺失，并檢測出NTRK1 雜合突變，為c.1784T>G（p.Leu595Arg）和（c.428-395_718+485delins CCCAGGCTGGAGTGCAGTGGC），提出先天性恒牙缺失可能發生在CIPA患兒中，強調了在多學科團隊中包括口腔頜面外科醫生和兒科牙醫的重要性。本例先證者2 只乳牙早脫落，可能與咬手指的自殘行為和牙齒發育不良有關。

目前報道NTRK1基因120種突變，包括錯義突變、無義突變、插入突變或者缺失突變、剪切位點突變等[7]。本病例NTRK1基因2個雜合突變。NTRK1 內含子2 上的c.287+2dupT 突變的病例見于以下報道[20-23]。2009年Lee 等[20]報道1例6歲診斷CIPA的女性患兒，在嬰兒期出現反復發熱、無汗、對疼痛不敏感、精神發育遲緩，幼兒期出現髖關節脫位和多處慢性骨髓炎，NTRK1基因2個雜合突變為c.287+2dupT 和p.Glu719Lys；2018年Wang 等[21]報道1例14歲女性患兒，有骨折和無汗表現，但無精神發育遲緩和自殘行為，NTRK1基因2個雜合突變為c.287+2dupT 和c.1549G>C（p.Gly517Arg）。耿興柱[22]對我國34個家系68個等位基因中鑒定有7個為c.287+2dupT 突變。2019年Li 等[23]報道1例5歲男性患兒，NTRK1基因2個雜合突變為c.446_447insTCTG （p.P149fs）和c.287+2dupT，有對疼痛不敏感、無汗、發熱、骨折等表現，無精神發育遲緩，其NTRK1基因突變c.446_447insTCTG（p.P149fs）突變與本例NTRK1基因突變c.447_450dupTCTG（p.His151fs）性質一致，本研究根據基因變異命名規則優先使用“重復”命名[24]。

綜上所述，本研究豐富了新生兒發病CIPA的基因譜，要注重新生兒期發病CIPA患兒牙齒發育情況，進行喂養指導防治體格生長遲緩。