半夏白術(shù)天麻湯物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC指紋圖譜及多成分定量分析

王淑玲 楊彗敏 李敏慧 徐 男 門(mén)連匯 王 悅 顧郁欣 白 雪 田 朝

1.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310012；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南 250014

半夏白術(shù)天麻湯是2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局首批發(fā)布的100 首經(jīng)典名方之一，目前還未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代中成藥品種已上市的情況，經(jīng)典名方大多為傳統(tǒng)的湯劑，受藥材基源、飲片質(zhì)量、煎煮方法等因素的影響，如何確保其制備方法與傳統(tǒng)方法保持一致，是經(jīng)典名方研究成敗的關(guān)鍵性核心問(wèn)題[1-2]。中藥指紋圖譜技術(shù)對(duì)于獲取整體特征性化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)、相對(duì)組成以及濃度分布等信息起著至關(guān)重要的作用，中藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定性、生產(chǎn)一致性、質(zhì)量定性定量鑒別考察的可行方法[1-2]，是目前普遍采用的既科學(xué)又合理的一種方法[3]。半夏白術(shù)天麻湯所含的重要活性成分主要是天麻素、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、異甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甘草次酸[4-6]。本研究采用HPLC指紋圖譜法建立半夏白術(shù)天麻湯中重要成分的含量測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)所含7種指標(biāo)成分進(jìn)行定量測(cè)定，旨在為系統(tǒng)研究半夏白術(shù)天麻湯的“物質(zhì)基礎(chǔ)”及研發(fā)經(jīng)典名方制劑一致性評(píng)價(jià)提供參考和依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

U-3000 HPLC 二極管陣列檢測(cè)器（賽默飛世爾科技公司）；FA1110 十萬(wàn)分之一電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；METTLER AE 242型萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）；LXJ-Ⅱ型離心機(jī)（上海醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.2 材料

18批半夏白術(shù)天麻湯藥材（如半夏、天麻、白術(shù)、橘紅、茯苓、甘草，藥材批號(hào)分別編號(hào)為S1～S18）均購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院鑒定：半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.） Breit.的干燥塊莖；天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖；白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖；橘紅為蕓香科植物柚Citrus grandis（L.） Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮；茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （schw.） Wolf.的干燥菌核；甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。

天麻素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)18011604）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)18041206）；柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)17052406）；甘草苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)16071504）；甘草次酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)16070701）；異甘草苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)18042008）；橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)15123105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inert Sustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；采用梯度洗脫：流動(dòng)相:乙腈∶水=A∶B，按照乙腈的比例進(jìn)行梯度洗脫，0～48 min（A%逐漸升高：3%→45%），48～60 min（A%逐漸升高：45%→100%）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；參比波長(zhǎng)：400 nm；柱溫：30℃。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 半夏白術(shù)天麻湯的提取

半夏白術(shù)天麻湯按照配方比例混合，加水500 mL，采用武火煮沸和文火慢煎兩種煎煮方式進(jìn)行煎煮，每次煎煮半小時(shí)，煎煮完成后，將濾液合并。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至2.30 g/mL 生藥質(zhì)量濃度。按以上方法制備供試品溶液，每種所選藥材為來(lái)自不同產(chǎn)地的三種藥材，進(jìn)行正交試驗(yàn)，制備18批半夏白術(shù)天麻湯。該提取方法由課題組前期優(yōu)選所得[7]。

2.2.2 單味藥材的提取

按照半夏白術(shù)天麻湯處方，分別稱(chēng)取方中6味藥材（半夏、白術(shù)、天麻、橘紅、茯苓、甘草），加水煎煮（武火煮沸、文火慢煎）2次，每次0.5 h，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后定容至10 mL。

2.2.3 供試品溶液的制備

2.2.3.1 半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液的制備 取“2.2.1”項(xiàng)下的半夏白術(shù)天麻湯提取液2 mL，加入甲醇溶液定容至25 mL。密閉后，250 W、40 kHz 超聲30 min 使其溶解。靜置放冷后再次稱(chēng)定質(zhì)量，添加甲醇溶液以補(bǔ)充減少的質(zhì)量。搖勻，用0.45 μm 孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，得到的續(xù)濾液即為半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液。

2.2.3.2 單味藥材供試品溶液的制備 取“2.2.2”項(xiàng)下的單味藥材提取液2 mL，參照“2.2.3.1”項(xiàng)下溶液制備方法，制備單味藥材供試品溶液。

2.2.3.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取方中藥材的6種半夏白術(shù)天麻湯組方藥，參照“2.2.1”“2.2.3.1”項(xiàng)下溶液制備方法，制得6種陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3.4 對(duì)照品混合溶液的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照 品甘草苷（4.68 mg）、異甘草苷（3.22 mg）、天麻素（5.67 mg）、橙皮苷（2.97 mg）、柚皮苷（3.60 mg）、甘草次酸（2.22 mg）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（3.08 mg），放入燒杯，用少量甲醇混合溶解，溶液全部倒入10 mL 容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻即得對(duì)照品混合溶液。

2.3 半夏白術(shù)天麻湯HPLC指紋圖譜結(jié)果

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3.1”項(xiàng)下的相同半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，選擇響應(yīng)值相對(duì)最高、峰型及保留時(shí)間穩(wěn)定、峰面積較大的柚皮苷峰為參照峰，結(jié)果顯示，共有峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rlative sandard deviation，RSD）全部小于2.90%，相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 全部小于0.80%，說(shuō)明該方法的精密度良好、可行。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3.1”項(xiàng)下的相同半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液，按照“2.1”色譜條件，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行檢測(cè)[8]，記錄指紋圖譜。選擇柚皮苷峰作為參照峰，所有共有峰的相對(duì)峰面積的RSD 全部小于2.60%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 全部小于0.98%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.3 重復(fù)性考察

分別取“2.2.1”項(xiàng)下半夏白術(shù)天麻湯（編號(hào)S1）6份，樣品制備參照“2.2.3.1”項(xiàng)下要求進(jìn)行，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，選擇柚皮苷峰為參照峰[9-14]，所有共有峰相對(duì)峰面積的RSD 全部小于2.80%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 全部小于0.88%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.4指紋圖譜建立

分別精密取18批“2.2.3.1”項(xiàng)下條件制備的相同半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定。采用軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012）”，將18批樣品的每一個(gè)指紋圖譜以頻道定義（channel definition format，CDF）格式分別依次導(dǎo)入其中，將S18 樣品圖譜設(shè)定為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗的寬度為0.10，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正色譜峰，自動(dòng)匹配得系列對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1（封三）。通過(guò)標(biāo)定，得共有峰25個(gè)。結(jié)果顯示，18批供試品溶液色譜圖與對(duì)照譜相似度均接近1，分別為0.997、0.983、0.994、0.992、0.995、0.986、0.991、0.997、0.996、0.992、0.995、0.994、0.992、0.989、0.993、0.995、0.997、0.998。提示本研究的18批樣品之間具有良好的相似度。

2.3.5 共有峰歸屬分析及鑒定

取“2.2.3.1”項(xiàng)下的相同半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液（藥材批號(hào)S1）、“2.2.3.2”項(xiàng)下各個(gè)單味藥的供試品溶液和“2.2.3.3”項(xiàng)下其相對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照供試品溶液，分別精密吸取10 μL，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，色譜條件按照“2.1”項(xiàng)下所規(guī)定的條件，將所有色譜圖保存記錄，結(jié)果見(jiàn)圖2（封三）。

對(duì)各個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬分析和鑒定，將“2.3.4”項(xiàng)下結(jié)果與紫外吸收光譜圖和保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，在匹配到的25個(gè)共有峰中，4、5號(hào)峰來(lái)自半夏，8號(hào)峰來(lái)自天麻，6、7、21、22、23、24號(hào)峰來(lái)自白術(shù)，9、12、15、16、17、18號(hào)峰來(lái)自橘紅，10、11號(hào)峰來(lái)自茯苓，13、14、19、20、25號(hào)峰來(lái)自甘草，其余無(wú)法明確判斷來(lái)源的共有峰有3個(gè)。

參照“2.1”項(xiàng)色譜條件，對(duì)混合對(duì)照品液進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，得色譜圖及共有峰，其中有7個(gè)是特征峰，分別為天麻素（8號(hào)峰）、甘草苷（14號(hào)峰）、柚皮苷（15號(hào)峰）、橙皮苷（16號(hào)峰）、異甘草苷（19號(hào)峰）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（21號(hào)峰）、甘草次酸（25號(hào)峰）。

圖1 18批半夏白術(shù)天麻湯方藥指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比對(duì)結(jié)果

圖2 半夏白術(shù)天麻湯方藥共有峰、特征峰

2.4 定量測(cè)定半夏白術(shù)天麻湯中的7種成分

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

將“2.2.3.1”項(xiàng)下半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液、“2.2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、“2.2.3.3”項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液（甲醇）各精密吸取10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

在甘草苷、天麻素、柚皮苷、異甘草苷、橙皮苷、甘草次酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品相應(yīng)位置，存在相同保留時(shí)間色譜峰，陰性對(duì)照品溶液相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明該方法陰性對(duì)照品溶液不干擾測(cè)定結(jié)果。

2.4.2 線性關(guān)系考察

圖3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果

稀釋“2.2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，得天麻素質(zhì)量濃度為0.1745、0.8725、1.7450、3.4900、6.9800 mg/mL；甘草苷質(zhì)量濃度為0.0041、0.0205、0.0410、0.0820、0.1640 mg/mL；柚皮苷質(zhì)量濃度為0.0738、0.3692、0.7385、1.4769、2.9538 mg/mL；橙皮苷質(zhì)量濃度為0.1218、0.6092、1.2185、2.4369、4.8738mg/mL；異甘草苷質(zhì)量濃度為0.0429、0.2147、0.4293、0.8587、1.7173 mg/mL；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量濃度為0.1974、0.9872、1.9744、3.9487、7.8974 mg/mL；甘草次酸質(zhì)量濃度為0.0085、0.0427、0.0854、0.1708、0.3415 mg/mL，得系列濃度對(duì)照品混合溶液。

參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，并記錄色譜峰面積。橫坐標(biāo)（X）為對(duì)照品質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，線性關(guān)系結(jié)果分別為：天麻素Y1＝0.001X1+0.308，r＝0.9995，線性范圍為0.1745～6.9800 mg/mL；甘草苷Y2＝0.041X2+0.114，r＝0.9995，線性范圍為0.0041～0.1640 mg/mL；柚皮苷Y3＝0.016X3+0.720，r＝0.9995，線性范圍為0.0738～2.9538 mg/mL；橙皮苷Y4＝0.002X4+0.221，r＝0.9995，線性范圍為0.1218～4.8738 mg/mL；異甘草苷Y5＝0.015X5+0.288，r＝0.9995，線性范圍為0.0429～1.7173 mg/mL；白術(shù)內(nèi)酯ⅢY6＝0.002X6+0.194，r ＝0.9995，線性范圍為0.1974～7.8974 mg/mL；甘草次酸Y7＝0.021X7+0.062，r＝0.9999，線性范圍為0.0085～0.3415 mg/mL。結(jié)果顯示，在各個(gè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各對(duì)照品均具有良好線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3.1”項(xiàng)下的供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，得各成分峰面積。結(jié)果顯示，天麻素、甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、異甘草苷、柚皮苷、甘草次酸、橙皮苷峰面積的RSD 分別為2.0%、2.1%、1.5%、2.1%、2.4%、2.8%、2.5%，表明該方法精密度較良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2.3.1”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)其中7種成分的含量，分別計(jì)算其峰面積。結(jié)果顯示，異甘草苷、甘草苷、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甘草次酸、天麻素、柚皮苷的峰面積RSD 分別為2.8%、2.1%、2.2%、1.9%、2.4%、2.3%、2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

參“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、4、8、12、16、24 h測(cè)定“2.2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液，計(jì)算7種成分的峰面積。結(jié)果顯示，異甘草苷、天麻素、柚皮苷、甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、橙皮苷、甘草次酸的峰面積RSD 分別為2.6%、1.6%、2.9%、1.3%、2.7%、2.7%、2.8%，表明該供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下半夏白術(shù)天麻湯溶液（批號(hào)S1）6份，精密稱(chēng)定每份12 g，分別加入5 mL的以下7種混合對(duì)照品溶液（天麻素0.701 mg/mL、甘草苷0.041 mg/mL、柚皮苷3.170 mg/mL、橙皮苷0.072 mg/mL、異甘草苷0.080 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.155 mg/mL、甘草次酸0.005 mg/mL），按照“2.2.3.1”項(xiàng)制備半夏白術(shù)天麻湯供試品溶液，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，得出各成分的平均回收率和RSD值。結(jié)果顯示，天麻素、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、異甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及甘草次酸的平均回收率分別為98.77%、99.01%、101.94%、102.14%、98.29%、103.47%、97.34%，RSD分別為2.39%、1.95%、2.44%、2.48%、2.50%、2.71%、1.93%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.7 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取18批半夏白術(shù)天麻湯藥材，按照“2.2.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)樣品中7種成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，18批樣品中各個(gè)成分的含量分別是：天麻素2.1933～5.0626 mg/g、甘草苷0.1220～0.2867 mg/g、柚皮苷7.3165～15.8486 mg/g、橙皮苷0.1301～0.3928 mg/g、異甘草苷0.1733～0.4524 mg/g、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.2361～0.7849 mg/g、甘草次酸0.0180～0.0372 mg/g。

表1 半夏白術(shù)天麻湯中7種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在190～600 nm 波長(zhǎng)下利用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，圖譜顯示，吸收波長(zhǎng)254 nm 處，色譜峰形較好、峰數(shù)較多、基線平穩(wěn)，其中7個(gè)特征峰響應(yīng)值均較高，故確定半夏白術(shù)天麻湯HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[15-19]。

流動(dòng)相的選擇：初步確定6種流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乙腈-（0.05%、0.1%）磷酸、乙腈-0.05%醋酸、乙腈-0.1%甲酸4種流動(dòng)相檢測(cè)的峰形響應(yīng)值過(guò)小、峰形不好；甲醇-水出現(xiàn)出峰時(shí)間長(zhǎng)、拖尾峰過(guò)長(zhǎng)的情況。故選擇乙腈-水作為半夏白術(shù)天麻湯指紋圖譜的流動(dòng)相。

3.2 多成分指紋圖譜

本實(shí)驗(yàn)在收集半夏白術(shù)天麻湯處方中6味組成藥味各主產(chǎn)地合格飲片的基礎(chǔ)上，參照正交設(shè)計(jì)表L18（37）排列組合，建立多產(chǎn)地來(lái)源藥材組成的中藥復(fù)方指紋圖譜。研究結(jié)果顯示，所有測(cè)得的樣品中的25個(gè)共有峰里，有22個(gè)已經(jīng)確定了藥材的歸屬，表明以該方法生成的對(duì)照指紋圖譜具有一定的代表性。本實(shí)驗(yàn)定量測(cè)定7個(gè)已知成分的含量范圍，初步建立半夏白術(shù)天麻湯的質(zhì)量控制體系，能夠反映半夏白術(shù)天麻湯的質(zhì)量穩(wěn)定，為系統(tǒng)研究該方的“物質(zhì)基準(zhǔn)”奠定基礎(chǔ)。由于復(fù)方中成分多而復(fù)雜，本研究工作量有限，只采用了單一的提取制備方法、檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相，不能全部分析并考察更多的活性成分。后續(xù)會(huì)借助高效液相多重質(zhì)譜儀，如：超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間二級(jí)質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS/MS）、超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-TOF/MS）[20]及二維液相等先進(jìn)現(xiàn)代分析儀器進(jìn)行深入研究。