胰高血糖素樣肽-1蛋白對帕金森病氧化應激損傷的保護作用及機制研究

彌婉軍，王曉娟

(1.渭南市中心醫院神經內科，陜西 渭南 714000；2.寶雞市中醫醫院腦病二科，陜西 寶雞 721000)

帕金森病是臨床上常見的神經中樞神經系統變性疾病，好發于中老年人[1]。該病在臨床上主要表現為姿勢步態障礙、肢體僵直、靜止性震顫、運動遲緩，病理特征為中腦黑質致密部多巴胺能神經元的缺失，可導致紋狀體多巴胺含量減少[2]。帕金森病的發病機制還不明確，但2型糖尿病與帕金森病互為發病的風險因子，各自發病存在共同的病理變化[3-4]。腸促胰島素是可以使胰島素增敏的生長因子家族，其中胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide 1，GLP-1)可通過增敏腦內的胰島素信號受體實現神經保護作用，其也可產生神經營養作用，促進神經細胞保護、增殖，并且有利于前體細胞向神經元分化[5]。有研究顯示GLP-1蛋白經腹腔給藥后可穿過血腦屏障進入腦組織，在神經元表面與相應受體結合后，可激活下游信號的表達，從而誘導神經元分化與促進神經元突觸生長[6]。Chi3l1基因在大腸、子宮、軟骨、腦組織、骨骼中都有廣泛表達，也為一種防御病原體結構中的幾丁質[7]。現代研究表明Chi3l1具有雙重作用[8]，可在各種微生物引起的免疫應答中發揮重要作用。本文具體探討了GLP-1蛋白對帕金森病小鼠氧化應激損傷的保護作用及機制，現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 36只8 周齡C57BL/6 雄性小鼠(15～20 g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養環境：12 h晝夜循環光照，清潔動物房環境安靜、溫度恒定(22±3)℃、濕度適宜(50%～55%)，自由飲食與飲水，每5 只小鼠居于1個籠內。為使小鼠適應環境，每只小鼠實驗前均有1周適應期。動物實驗得到了本院動物倫理委員會的批準，并嚴格按照動物倫理學要求進行操作。GLP-1/GIP雙受體激動劑(DA3-CH)購自美國BD公司，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)購自武漢博士德公司，一抗與二抗購自武漢三鷹公司，Chi3l1酶聯免疫檢測試劑盒購自上海生工公司，利拉魯肽購自國藥集團。

1.2 動物分組 將所有小鼠隨機平分為三組：模型組、利拉魯肽組與GLP-1組。所有小鼠都給予建立帕金森病模型，通過腹腔給藥將20 mg/kg的MPTP 溶液注入小鼠體內。30 min后模型組在建模過程中給予0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液注射，連續7 d。利拉魯肽組在建模過程中給予利拉魯肽腹腔注射25 nmol/(kg·d)，連續7 d。GLP-1組在建模過程中給予DA3-CH 腹腔注射25 nmol/(kg·d)，連續7 d。

1.3 觀察指標 ①在建模第1天與第7天進行轉棒實驗，測定小鼠的運動平衡能力，將小鼠放置于運轉時間為180 s、轉速20 r/min的滾輪上，記錄從轉軸開始轉動到小鼠掉落所持續的時間。②在建模第1天與第7天進行牽拉實驗,將小鼠雙前肢置于水平細繩上，可評定小鼠的四肢肌力。3分：四肢全都能夠抓緊細繩；2分：只有一個后肢可以抓緊細繩；1分：沒有后肢可以抓緊細繩；0分：無法抓緊細繩而掉落。③在建模后第7天處死小鼠，取眼球血1 ml左右，靜置30 min后4℃ 3000 r/min離心10 min，分離上層血清，采用酶聯免疫法檢測血清Chi3l1含量。④取處死大鼠的腦組織，稱重后進行裂解，置于組織研磨器內，進行充分研磨，12000 r/min離心10 min，取上清，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后在室溫下封閉2 h，在4 ℃溫育過夜的一抗(抗IBA-1抗體、抗GFAP抗體，1∶1000；抗β-actin抗體，1∶2000)，洗滌后進行二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，洗滌后用Molecular Imager 顯現印跡，記錄目的蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 三組建模不同時間點轉棒實驗結果對比 三組建模第7天的轉棒停留時間都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。見表1。

表1 三組建模不同時間點轉棒實驗結果對比(s)

2.2 三組建模不同時間點牽拉實驗結果對比 三組建模第7天的轉棒停留時間牽拉肌張力評分都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。見表2。

表2 三組建模不同時間點牽拉實驗結果對比(分)

2.3 三組建模第7天血清Chi3l1含量對比 利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的血清Chi3l1含量低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。見表3。

表3 三組建模第7天血清Chi3l1含量對比(pg/ml)

2.4 三組建模第7天腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對表達水平對比 利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對表達水平低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。見表4。

表4 三組建模第7天腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對表達水平對比

3 討 論

帕金森病為臨床上的神經退行性疾病之一，以黑質多巴胺能神經元變性缺失和路易小體形成為病理特征，在臨床上主要表現為姿勢平衡障礙、肌強直、運動遲緩等運動癥狀[9]。同時很多患者伴隨有抑郁、認知功能障礙、睡眠障礙等非運動癥狀，從而嚴重影響患者的身心健康[10]。MPTP是一種親脂性化合物，可以穿過血腦屏障；腹腔內注射MPTP可建立帕金森病小鼠模型，也是基礎研究中廣泛應用的小鼠模型。GLP-1是由小腸L細胞分泌的一種多肽激素，可以高效地通過血-腦屏障，可通過多環節機制發揮降糖作用，從而具有一定的神經保護作用[11-12]。本研究顯示三組建模第7天的轉棒停留時間、牽拉肌張力評分都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。從機制上分析，DA3-CH是GLP-1/GIP 雙受體激動劑的一種，可介導神經細胞的增殖，能促進小鼠齒狀回神經母細胞分化和神經再生[13]。有研究給予野生型Sprague-Dawley大鼠GLP-1類似物，發現其可改善大鼠的Morris水迷宮實驗行為能力，但此現象可以被GLP-1拮抗劑逆轉[14]。

Chi3l1基因位于染色體1q32.1上一個高度保守的區域，含有10個外顯子，與IL-6受體基因(1q21)，與CRP基因(1q21-1q23)位于1號染色體的同一臂上。Chi3l1基因啟動子序列包括多種調節因子的結合位點，但是也具有多個突變位點。已有研究顯示Chi3l1基因啟動子區域的三個單核苷酸多態性與機體的氧化應激水平相關，基因突變位點發生變化時，可增強Chi3l1基因與CCATT 序列增強子結合蛋白的結合力，而后者具有轉錄活化作用，從而調節下游基因的表達[15]。本研究顯示利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的血清Chi3l1含量低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。從機制上分析，帕金森病能夠造成小鼠氧化應激損傷，GLP-1蛋白治療能夠抑制Chi3l1的釋放，從而具有預防氧化應激損傷的作用[16]。當前有研究也顯示DA3-CH可呈劑量依賴性保護神經細胞過氧化氫介導的細胞凋亡，減少自由基的釋放[17]。

IBA-1 特異性表達于小膠質細胞，其也屬于一種鈣結合蛋白，是小膠質細胞的標記蛋白。GFAP 參與細胞骨架構成，其作為一種中間絲狀蛋白，要存在于星型膠質細胞胞漿內[18]。帕金森病可導致小鼠運動障礙，導致IBA-1 與BDNF 的廣泛釋放，也使得膠質細胞及星型膠質細胞增殖程度降低，可激活神經炎癥反應[19-20]。本研究顯示利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對表達水平低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。從機制上分析，DA3-CH能神經元的損傷程度降低，間接減少小膠質細胞及星型膠質細胞增殖，從而抑制IBA-1、GFAP蛋白的表達。本研究也存在一定不足，沒有進行細胞學研究，也沒有進行劑量學分析，將在后續研究中進行探討。

總之，GLP-1蛋白在帕金森病小鼠的應用能緩解氧化應激損傷，抑制血清Chi3l1與腦組織IBA-1、GFAP蛋白的表達，從而發揮神經保護作用。