視黃酸相關孤兒受體-白介素-23信號通路誘導病理性Th17細胞分化介導血壓升高機制研究

王 敏，吳春立，魏芳晶，于賽華，陰淑瑩，李愛英，任保軍

(內蒙古醫科大學附屬醫院心血管內科，內蒙古 呼和浩特 010010)

原發性高血壓是以體循環動脈壓升高為主要臨床表現的心血管綜合征，是重要的心腦血管病危險因素，可損傷重要器官如心、腎、腦的結構和功能，最終導致這些器官功能衰竭，探索高血壓發病機制并積極開展有效防治刻不容緩。人們對于高血壓病的發病機制進行了大量的研究，表明多種因素參與了高血壓病的發病機制，包括遺傳環境、解剖、適應性、神經系統、內分泌體液因子以及血流動力學。鹽敏感性是連接鹽與高血壓的遺傳基礎，是原發性高血壓的一種中間遺傳表型。不同的患者對鹽的敏感性存在差異，分為鹽敏感性和非鹽敏感性患者，前者患高血壓的幾率相對較大，約為50%～60%[1-2]。與血壓鹽敏感性相關聯的高血壓稱為鹽敏感性高血壓 (Saltisensitive hypertension，SSHT)。研究表明，鹽敏感人群的高血壓發病率和病死率均高于鹽抵抗性人群[3-4]，但發病機制不明。

既往研究證實內皮功能障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統異常、交感神經系統激活、離子轉運異常等參與SSHT的發生和發展。同時高血壓是一種慢性炎癥綜合征，免疫異常參與其中，其中尤以病理性輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)明顯。Th17分泌白介素-17A(Interleukin-17，IL-17A)可引起血管內皮功能異常，誘發內源性一氧化氮(NO)減少至血管收縮，同時產生炎癥損傷導致血管重構，血管硬化、血壓升高[5]。白介素-23(Interleukin-23，IL-23)是促使Th17分泌IL-17及維持病理形態的重要細胞因子，它通過上調IL-23受體(IL-23R)并與之結合產生以上效應。視黃酸相關的孤兒受體(RORγt)是Th17細胞發育所必需的，RORγt在IL-23R的產生過程中發揮著重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化過程中IL-23R明顯減少，因此高鹽可能通過以上位點在高血壓發病中發揮作用。本項目將從高鹽導致病理性Th17細胞分化這一全新的視角，首次探討RORγt-IL-23R信號通路在SSHT發病中的作用，探討SSHT發病的免疫機制，為高血壓的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2019年6月在內蒙古醫科大學附屬醫院心內科病區住院的高血壓患者，經患者同意后，予鹽負荷試驗，通過此試驗篩選SSHT患者，及非鹽敏感性高血壓患者各30例，正常血壓人群健康志愿者30例為對照組，抽取外周靜脈血。其中，男52 例，女38例；年齡43～71歲，平均(57.63±9.24)歲。依據高血壓分級標準分為：高血壓Ⅰ級43 例，高血壓Ⅱ級27 例和高血壓Ⅲ級21 例。高血壓組和健康對照組性別、年齡等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。病例納入標準：符合原發性高血壓診斷標準。排除標準：不同意參加實驗研究者，合并嚴重疾病者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象都簽訂了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Th17細胞分化機制：①樣本收集與分組：選擇內蒙古醫科大學附屬醫院心內科病區住院的高血壓患者，經患者同意后，予鹽負荷試驗，通過此試驗篩選SSHT患者，選取SSHT及非鹽敏感性高血壓患者各30例，正常血壓人群健康志愿者30例，抽取外周靜脈血。②檢測正常血壓人群健康志愿者、鹽敏感性高血壓患者及非鹽敏感性高血壓患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞比例：將各組外周靜脈血高速冷凍離心機梯度離心，分離外周單個核細胞，使用抗IgG磁珠陰性分選單個核細胞中總CD4+T細胞，釆用流式細胞技術檢測CD4+IL-17A細胞比例。 ③檢測正常血壓人群健康志愿者、SSHT患者及非鹽敏感性髙血壓患者外周血IL-17A：將各組外周血離心后取上層血清，ELISA檢測IL-17A。

1.2.2 RORγt-IL-23R信號通路：①檢測正常環境、不同濃度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下人初始CD4+T細胞中Th17細胞比例：分離正常血壓健康志愿者外周血總CD4+T細胞(方法如前述)，釆用流式活化細胞分選儀，分選初始CD4+T細胞(CD45RA、CD45RO、CD25、CD127)體外培養，此后分別加入不同濃度NaCl(0、10、20、40、80 mmol/L)， 4 h后釆用流式細胞技術檢測各組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例。②檢測正常環境、不同濃度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下外周血IL-17A：將各組外周血離心后取上層血清，ELISA檢測IL-17A。③40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑，觀察對Th17細胞分化影響，檢測P38-RORγt-IL-23R信號通路：40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞加入RORγt拮抗劑，檢測IL-17A表達變化，流式細胞技術檢測Th17細胞比例； 40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞加入IL-23R拮抗劑，檢測IL-17A表達變化，流式細胞技術檢測Th17細胞比例。

2 結 果

2.1 各組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞比例 與對照組相比鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例明顯增高，具有統計學意義，與對照組相比非鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞比例

2.2 各組外周血CD4+Th17細胞占IL-17A細胞比例 與對照組相比鹽敏感性高血壓組的IL-17A比例差異無統計學意義(P>0.05)，與對照組相比非鹽敏感性高血壓組的IL-17A 比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血CD4+Th17細胞占IL-17A細胞比例(%)

2.3 不同濃度NaCl干預下各組 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例 不同濃度NaCl培養人初始CD4+T細胞，CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均增高，并且隨著NaCl濃度增高， CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例逐漸增高。見圖2。

圖2 不同濃度NaCl干預下各組 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例

2.4 不同濃度NaCl干預下CD4+Th17細胞/CD4+T細胞 不同濃度NaCl培養人初始CD4+T細胞中IL-17A水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。并隨著培養基NaCl濃度的增高，CD4+T細胞中IL-17A水平逐漸增高。見表2。

表2 不同濃度NaCl干預下CD4+Th17細胞/CD4+T細胞(%)

2.5 40 mmol/LNaCl下CD4+T細胞分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例 40 mmol/L NaCl培養人初始CD4+T細胞組做對照組，與對照組相比加入RORγt拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例減少，與對照組相比加入IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例減少。見圖3。

圖3 加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例

3 討 論

2017中國心血管病報告，中國心血管患者仍然持續增加，心血管病現患人數2.9億。隨著我國人民生活水平的提高和人口老齡化，冠心病、高血壓疾病患病率明顯增加[6]。 以高血壓為危險因素誘發的心腦血管疾病目前持續上升趨勢，進行高血壓有效防治意義重大，探索其發病機制刻不容緩。鹽敏感性是鹽與高血壓的鏈接基礎，但機制不明。SSHT[7-9]的特征在于響應于膳食鹽攝入增加的血壓升高，并且與心血管和腎臟疾病的風險增加相關。其與種族、地理環境、社會因素、腎臟功能、激素和飲食習慣等相關。近年來的研究發現高鹽可使初始CD4+細胞向病理性的TH17細胞分化[10-11]。近年來的研究表明，高血壓伴有局部和系統性的炎癥反應，與免疫炎癥相關的淋巴細胞及其細胞因子參與了高血壓的發生與發展[12-14]。研究表明，抑制高血壓 T 淋巴細胞參與的炎癥反應，就能夠減輕血壓升高及其導致的靶器官損害[15]。

Th17細胞屬CD4+效應T細胞亞群,參與介導炎性反應、自身免疫性疾病的發生和發展。分化成熟的Th17分泌IL-17,在多種自身免疫性疾病和炎性疾病中起關鍵作用[16]。TH17在高血壓的發病中起著重要作用，TH17分泌IL-17A可引起血管內皮功能障礙，導致內源性NO減少血管收縮，同時炎癥損傷導致血管重構，血管硬化、血壓升高[17-18]。實驗結果顯示鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于健康志愿者組。不同濃度NaCl培養人初始CD4+T細胞，CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均高于健康志愿者組，并且隨著NaCl濃度增高， CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例逐漸增高。表明SSHT患者外周血TH17細胞比例及IL-17升高，并與鹽濃度顯正相關。說明TH17細胞引起的免疫反應參與了高血壓的進程，促進SSHT的發生。

IL-23 是一種新的免疫調節因子，研究證明IL-23在一些自身免疫性疾病中存在前炎性反應活性[5]。IL-23是促使Th17分泌IL-17及維持病理形態的重要細胞因子，它通過上調IL-23受體(IL-23R)并與之結合產生以上效應。視黃酸相關的孤兒受體(RORγt)是Th17細胞發育所必需的，也在IL-23R的產生過程中發揮著重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化過程中IL-23R明顯減少。 本研究結果顯示高濃度NaCl培養基下CD4+T細胞中分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均較40 mmol/L NaCl培養人初始CD4+T細胞組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例降低，說明RORγt-IL-23R信號通路可誘導病理性Th17細胞分化從而導致SSHT的發生。

綜上所述，TH17細胞引起的免疫反應參與了高血壓的進程，促進SSHT的發生。RORγt-IL-23R信號通路可誘導病理性Th17細胞分化從而導致SSHT的發生。