原纖維蛋白1在胃癌組織中的表達及與預后的關系

郭 棟，魏 鵬，梁 剛，楊學超

(陜西核工業二一五醫院,陜西 咸陽 712000)

胃癌(Gastric cancer,GC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌每年的新確診人數約占世界范圍的40%以上，嚴重損害患者的身心健康[1]。近年來，雖然關于胃癌發生、發展的分子機制研究已經獲得了重大進展，但是與胃癌患者預后相關的分子標志物仍需進一步研究[2-3]。原纖維蛋白-1(Fibrillin-1，FBN1)是構成細胞外基質微纖維的主要成分，其主要作用是保持結締組織的形態完整和功能正常[4]。據報道，卵巢癌、結腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌樣本中FBN1基因的表達量和拷貝數均明顯增多，且與患者預后密切相關[5-8]。本研究通過測定FBN1在胃癌及其配對癌旁組織中的表達水平及與患者預后的相關性，探討其在胃癌發生、發展過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2013年12月期間行胃癌根治術患者的石蠟包埋標本100例，其中男54例，女46例；年齡38～76歲，平均(55.85±11.80)歲；中高分化44例，低分化56例；T1-T2 35例，T3-T4 65例；淋巴轉移49例，無淋巴轉移51例；Ⅰ-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期64例。另取距腫瘤邊緣>2 cm的配對癌旁組織100例作為對照。本研究經陜西省核工業215醫院倫理委員會批準。組織標本經患者本人知情簽字。 病例納入標準：①符合《消化系統腫瘤病理學和遺傳學》制定的胃癌相關診斷標準；②術前均未進行放化療；③所取配對癌旁組織無任何癌細胞浸潤；④臨床資料完整。排除標準：①術前確診合并其他臟器有功能障礙性疾病或惡性腫瘤的患者；②術前服用影響研究指標的藥物；③不接受隨訪；④免疫組化染色結果不佳。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑：兔抗人FBN1多克隆抗體購自上海恒斐生物科技有限公司，SP免疫組化試劑盒均購自武漢純度生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 檢測方法：采用免疫組化SP法，切取100例胃癌及癌旁組織石蠟標本，厚度5 μm；將組織石蠟塊在50 ℃溫水中展平，然后用處理干凈的載玻片撈片；68 ℃恒溫箱烤片2 h；常規脫蠟、水化；80%甲醇卵孵10 min后，將切片置入0.01 mol/L緩沖液(pH6.0)中，進行水溶鍋煮沸，時間為20 min。隨后在室溫條件下，使用5%BSA封閉液開展孵育，時間為30 min，甩干后，滴加一抗50 μl(FBN1 濃度為1∶100)，于4 ℃條件下過夜。室溫下，將帶有HRP標記的二抗50 μl加入后，靜置1 h。滴加SP，37 ℃卵育1 h；(以上各步驟間均用PBS沖洗3次，每次5 min)，隨后進行DAB顯色，顯色時間為10 min。將標本在水下進行沖洗，沖洗時間為10 min，隨后使用蘇木精開展復染操作，時間為2 min。最后進行常規的脫水、封片、鏡檢，在操作中對照采用PBS液代替一抗。

1.3 觀察指標 ① FBN1蛋白在胃癌和癌旁組織的表達：FBN1定位于胃癌組織細胞漿或胞膜，出現黃色顆粒為陽性染色，陽性表達率根據細胞染色強度和陽性細胞占比進行計算。細胞染色強度計分標準：無顯色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按光學顯微鏡下(×400)陽性細胞百分率計分，陽性細胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項分值相加≥3分為高表達，<3分為低表達。②不同FBN1蛋白表達水平胃癌患者的臨床病理特征分析： 臨床病理特征包括年齡、性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置等。比較不同臨床病例特征患者的FBN1蛋白表達情況。③FBN1蛋白不同表達情況胃癌患者的生存分析：電話隨訪100例行胃癌根治術的患者，隨訪時間以手術當天起至隨訪截止時間或患者死亡，隨訪截止時間為2019年5月31日。根據隨訪結果，比較FBN1蛋白高表達和低/陰性表達胃癌患者的生存時間。④影響胃癌患者術后生存的多因素分析：使用Cox回歸分析影響胃癌患者術后生存的獨立危險因素。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行分析。計數資料組間比較以[例(%)]表示，采用χ2檢驗。生存分析用 Kaplan-Meier，組間對比用Log-Rank 檢驗，使用Cox回歸分析影響胃癌患者術后生存的獨立危險因素，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FBN1蛋白在胃癌和癌旁組織的表達 胃癌組織中，FBN1蛋白陽性高表達61例，高表達率為61.00%，低表達31例，低表達率為31.00%，陰性表達8例，陰性表達率8.00%，陽性表達率92.00%。癌旁組織中FBN1蛋白高表達8例，高表達率8.00%，低表達32例，低表達率32.00%，陰性表達60例，陰性表達率60.00%，陽性表達率40.00%。胃癌組織中FBN1蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。FBN1在胃癌組織中陽性表達為腫瘤細胞漿或包膜有棕黃色顆粒，見圖1A；FBN1在癌旁組織中的陰性表達見圖1B。

A:胃癌組織FBN1陽性表達；B：癌旁組織FBN1陰性表達

2.2 不同FBN1蛋白表達水平胃癌患者的臨床病理特征分析 胃癌組織中FBN1蛋白高表達患者的胃癌浸潤深度T3-T4、淋巴結轉移及TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期發生率明顯高于FBN1蛋白低/陰性表達患者(P<0.05)。胃癌組織中FBN1蛋白高表達患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤直徑、腫瘤位置與FBN1蛋白低/陰性表達患者相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同FBN1蛋白表達水平胃癌患者的臨床病理特征分析[例(%)]

2.3 FBN1蛋白不同表達情況胃癌患者的生存分析 100例胃癌患者均獲得有效隨訪，隨訪時間2～65個月，中位隨訪時間33個月，隨訪過程中46例因胃癌死亡。FBN1蛋白高表達患者生存時間(35.30±2.70)個月，FBN1蛋白低/陰性表達患者平均生存時間(52.69±3.12)個月，經Log-Rank檢驗，FBN1蛋白高表達患者生存時間顯著低于FBN1蛋白低/陰性表達患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 FBN1蛋白不同表達情況胃癌患者的生存分析

2.4 影響胃癌患者術后生存的多因素分析 Cox回歸分析顯示，FBN1蛋白高表達、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化以及淋巴結轉移均為影響胃癌患者術后生存的獨立危險因素。見表2。

表2 影響胃癌患者術后生存的多因素分析

3 討 論

胃癌屬于世界上發生率較高的惡性腫瘤，嚴重危害者人類的身體健康，研究胃癌發生、發展機制，并進行有效的治療在臨床中意義重大[9]。然而，由于早期胃癌的隱匿性和民眾篩查意識的缺乏，導致大多數胃癌患者確診時疾病已發展到進展期。胃癌根治術仍是臨床中對患者的主要推薦治療方法，能夠改善患者臨床癥狀，延緩病情進展。但是研究發現，由于胃癌患者術后復發、轉移率高，導致患者整體預后差、生存期較短[10-11]。近年來，靶向藥物作為惡性腫瘤患者的補充治療手段日漸備受重視[12]。因此，尋找新的藥物靶點，改善胃癌患者預后及延長其生存期成為當今轉化醫學研究的熱點。

原纖維蛋白(FBN)被發現參與了癌癥的發病機制[13]。原纖維蛋白家族(FBN)由FBN1、FBN2、FBN3、FBN4等4個成員組成，主要分布于結締組織中，屬于細胞外基質中微纖維的主要成分[14]。FBN1作為纖維蛋白家族成員之一，是由位于常染色體15q21.1區域，長約230 kb，含有65個外顯子的基因編碼的是一個很大的細胞外基質糖蛋白，可以形成細長的絲狀體,微纖維,它可以為組織提供結構支撐,形成皮膚彈性纖維和血管及儲存轉化生長因子β(TGF-β)蛋白[15]。一系列研究發現，FBN1主要作為促癌因子在眾多腫瘤組織中廣泛表達，通過Wnt/β-catenin信號通路及基質金屬蛋白酶(MMPs)家族介導上皮間質轉換途徑影響胃癌的發生發展，其表達程度遠高于相對應的正常組織，其表達水平及拷貝量的變化有可能與腫瘤的發生與發展存在關系，包括：結腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌及膽管癌等[16-17]。目前FBN1在眾多腫瘤組織中的過表達已有報道，然而有關FBN1在胃癌領域的研究報道甚少，通過胃癌中FBN1蛋白的研究能夠擴充FBN1在腫瘤中的研究領域，而且有望發現胃癌新的標記物及治療的新靶標。

本研究發現FBN1蛋白主要在胃癌組織細胞中的胞質和或胞膜中表達，且FBN1在胃癌組織中的表達水平明顯高于配對癌旁組織(P<0.05)，研究結果與倪曉飛等[15]研究結果一致。Zhang等[18]也發現FBN1表達上調可能提示卵巢癌的早期復發和對鉑類化療的敏感性。Wang等[19]研究發現FBN1促進卵巢癌轉移。Guo等[20]發現 FBN1啟動子的甲基化狀態是結腸直腸癌的一種高特異性、敏感的生物標志物。此外，本研究通過對FBN1蛋白表達情況與患者病理特征的相關性分析，發現FBN1蛋白的高表達和胃癌浸潤T3-T4、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期以及淋巴結的轉移，具有明顯的相關性，但與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直徑等因素無關。且腫瘤的浸潤程度越深、有淋巴結轉移、TNM分期越高，則患者FBN1蛋白的陽性表達水平越高，這說明FBN1可能作為一種促癌基因在胃癌發生發展機制中發揮著關鍵作用。但是FBN1在胃癌發生、發展過程中的具體機制仍需擴大樣本進一步分析研究。

此外，對胃癌患者的預后分析發現，FBN1蛋白高表達的胃癌患者生存時間明顯低于FBN1蛋白低/陰性表達的患者，且FBNI蛋白高表達為影響胃癌患者術后生存的獨立危險因素，提示FBN1水平的上調可導致胃癌患者生存期變短，FBN1可作為判斷胃癌患者預后的重要指標。然而，關于FBN1與胃癌患者預后判斷中的應用價值還需深入研究。

綜上所述，FBN1蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期密切相關，并可作為胃癌患者術后生存時間的評估指標。然而未來仍需開展更進一步的深入研究，以明確FBN1蛋白在胃癌預后判斷和治療方案指導中的意義。