探討HBV—DNA定量檢測核酸提取過程中的影響因素分析

崔紅艷

[摘要] 目的 探討HBV-DNA（乙肝病毒的脫氧核糖核酸）定量檢測核酸提取過程中的影響因素。方法 方便選取2018年1—4月內蒙古赤峰市中心血站經ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，分別統計不同濃縮液劑量、不同沉淀搖勻方式和不同裂解煮沸時間的Ig HBV-DNA測定結果，并對各項結果進行統計學分析。 結果 不同濃縮液組別的測定結果與標準方式相比，差異無統計學意義（t=0.140、0.036、0.069、1.088，P>0.05）；B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）與標準方式（4.178±0.175）相比，差異有統計學意義（t=2.437、2.082，P<0.05），B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）與標準方式相比，差異無統計學意義（t=1.412、0.835，P>0.05）；C1（4.134±0.160）與標準方式（4.203±0.155）對比，明顯偏低，差異有統計學意義（t=2.682，P<0.05），C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）與標準方式對比，差異無統計學意義（t=0.334、1.102、0.679，P>0.05）。 結論 一定范圍內適當改變濃縮劑量、沉淀搖勻方式和裂解煮沸時間并不會對檢測結果造成較大影響，但經過預熱處理后，振蕩搖勻會促使核酸釋放和沉淀混勻，臨床上要注意相關因素的影響，以提高檢測結果的準確性。

[關鍵詞] HBV-DNA；定量檢測；核酸提取；影響因素

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）10（c）-0029-03

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of nucleic acid extraction in HBV-DNA （deoxyribonucleic acid）. Methods From January to April 2018， 75 qualified blood samples were tested by ELISA in the blood bank of Chifeng City Center in Inner Mongolia. The doses of different concentrates， different sedimentation methods and different pyrolysis time were counted of Ig HBV-DNA assay results， and statistical analysis of the results was implemented. Results The results of different concentrate groups were not significantly different from the standard methods （t=0.140， 0.036， 0.069， 1.888， P>0.05）； B1 （4.123±0.187） and B4 （4.235±0.160） Compared with the standard method （4.178±0.175）， the difference was statistically significant （t=2.437， 2.082， P<0.05）， B2 （4.136±0.189）， B3 （4.201±0.162） compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=1.412， 0.835， P>0.05）； C1 （4.134±0.160） was significantly lower than the standard method（4.203±0.155）， the difference was statistically significant （t=2.682， P<0.05）， C2（4.195±0.138）， C3 （4.232±0.167） and C4（4.221±0.169） were compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=0.334， 1.102， 0.679， P>0.05）. Conclusion Appropriate changes in concentration dose， sedimentation and pulverization boiling time within a certain range will not have a great impact on the test results， but after pre-heat treatment， shaking will promote the release of nucleic acid and precipitation， clinically pay attention to the influence of relevant factors to improve the accuracy of the test results.

[Key words] HBV-DNA； Quantitative detection； Nucleic acid extraction； Influencing factors

慢性乙型肝炎是臨床上發病率較高的一類疾病，主要是指受檢者的乙肝病毒檢測結果呈陽性，HBsAg陽性率在10%以下。熒光定量PCR技術融合了PCR技術、雜交技術和光譜技術，通過采集和分析熒光，達到對原始模板進行定量的目的[1-3]。核酸DNA模板的提取過程是關系到定量結果的關鍵性環節，尤其是對于病毒水平偏低的樣本，產生的影響會更加突出。該研究以2018年1—4月中心血站經ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，旨在分析HBV-DNA定量檢測核酸提取過程中的影響因素，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便中心血站經ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，其中，檢出HBV真陽性25例，其中包括男性15例，女性10例；年齡最大52歲，年齡最小21歲，平均年齡為（38.86±2.31）歲。非活動性HBsAg攜帶者20例，其中包括男性11例，女性9例；年齡最大51歲，年齡最小20歲，平均年齡為（38.75±2.46）歲。輕度慢性乙型肝炎受檢者30例，其中包括男性18例，女性12例；年齡最大50歲，年齡最小20歲，平均年齡為（38.96±2.54）歲。所有入選病例均經醫院倫理委員會批準，且患者和家屬知情同意。

1.2 研究方法

濃縮液：標準組的濃縮液劑量為100 μL，A1的濃縮液劑量為90 μL，A2的濃縮液劑量為95 μL，A3的濃縮液劑量為105 μL，A4的濃縮液劑量為110 μL。五組除濃縮液劑量不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進行操作。

沉淀搖勻方式：標準組的沉淀搖勻方式為直接敲打混勻15 s，B1的沉淀搖勻方式為漩渦振蕩儀振蕩15 s，B2組沉淀搖勻方式為漩渦振蕩儀振蕩30 s，B3沉淀搖勻方式為56℃預熱120 s再漩渦振蕩15 s，B4沉淀搖勻方式為56℃預熱180 s再漩渦振蕩15 s。五組除沉淀搖勻方式不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進行操作。

裂解煮沸時間：標準組的裂解煮沸時間為10 min，C1的裂解煮沸時間為6 min，C2的裂解煮沸時間為8 min，C3的裂解煮沸時間為12 min，C4的裂解煮沸時間為14 min。5組除裂解煮沸時間不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進行操作。

1.3 觀察指標

①對不同劑量濃縮液與標準濃縮液的測定結果進行統計，并對各組數據進行統計學處理。

②對不同搖勻方式與標準方式的測定結果進行統計，并對各組數據進行統計學處理。

③對不同裂解時間與標準方式的測定結果進行統計，并對各組數據進行統計學處理。

1.4 統計方法

該研究中的所有數據均納入SPSS 16.0統計學軟件中，計數資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料用平均數±標準差（x±s）的形式表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準方式與不同劑量濃縮液的測定結果對比分析

不同濃縮液組別的測定結果與標準方式相比，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 標準方式與不同搖勻方式的測定結果對比分析

B1（漩渦振蕩儀振蕩15 s）和B4（56℃預熱180 s再漩渦振蕩15 s）與標準方式相比，差異有統計學意義（P<0.05），B2、B3與標準方式相比，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 標準方式與不同裂解時間的測定結果對比分析

C1（裂解煮沸時間為6 min）與標準方式對比，明顯偏低，差異有統計學意義（P<0.05），C2、C3和C4與標準方式對比，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

3 討論

實時熒光定量PCR技術可以反映出患者體內的HBV感染情況，同時也可以評估治療后的恢復情況，為臨床診療提供指導。采用此種方法進行檢測，不需要進行PCR后處理，可有效的避免發生交叉感染，提高了定量的準確性，是目前用于乙肝和其他傳染病的主要技術[4-6]。但PCR的檢測結果仍然會受到一些因素的影響，導致檢測結果不準確。該研究對較為常見的3種影響因素進行進一步的分析和探討，在堅持方便操作、結果準確的原則基礎上，對濃縮劑量、沉淀混勻方式和煮沸裂解時間等提取核酸的關鍵性影響因素進行研究，現進行具體分析。

首先，分析濃縮液劑量對檢測結果的影響。濃縮液本身的粘稠度相對較高，如果在檢測過程中出現加樣槍使用不規范或不標準的情況，這則會導致在加入檢測管的過程中出現加入量過多或加入量不足的情況。上述情況往往會出現在剛剛進入臨床實習的學生或是剛進入臨床工作的相關人員身上，一些工作經驗豐富的工作人員出現此類錯誤的可能性是非常小的。因此，上述結果可能會產生的影響并不是很明確，該研究在其他條件都不改變的情況下，改變濃縮液的劑量，再進行測試。經研究發現，結果顯示，濃縮液劑量上，不同濃縮液組別的測定結果與標準方式相比無顯著差異，這說明在確保嚴格執行說明書操作規范的情況下，對濃縮液劑量進行適當增減，并不會影響最終的測定結果。

其次，分析沉淀搖勻方式對檢測結果的影響。雖然采用敲打混勻的方式，可以讓沉淀徹底溶解，但此種方法會導致EP管破裂造成污染，而不同操作人員的敲打時間和敲打力度都是存在一定差異的，這對于操作的規范化是非常不利的。采用高速漩渦振蕩儀則可以很好的彌補這一缺陷，并且可以對敲打時間和敲打力度進行有效控制，檢測出管底部受力是否均勻。在該組研究結果中，B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）與標準方式（4.178±0.175）相比，差異有統計學意義，B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）與標準方式相比，差異無統計學意義，這說明其余兩種方式可成為替代操作方式，對核酸的釋放可起到有利作用，沉淀溶解可以更加完全[7-8]。

最后，分析煮沸時間對檢測結果的影響。在工作中，往往會因為多種因素影響煮沸時間，煮沸時間不夠或者是煮沸時間相對較長，則會導致結果的準確性受到不同程度的影響。C1（4.134±0.160）與標準方式（4.203±0.155）對比，明顯偏低，C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）與標準方式對比差異無統計學意義。這說明煮沸時間不夠，病毒難以完全釋放，會導致檢測結果偏低。這與黎茵[9]報道中的結果相似，黎茵報道中提出，標準組與旋渦混勻15 s組（4.125±0.186）以及56℃預熱180 s（4.199±0.164）后在旋渦沉淀混勻15 s組之間存在較大差異，裂解煮沸時間6min組（4.195±0.138）和裂解煮沸時間10 min組（4.222±0.168）之間的差異較大，差異有統計學意義（P<0.05）。

綜上所述，一定范圍內適當改變濃縮劑量、沉淀搖勻方式和裂解煮沸時間并不會對檢測結果造成較大影響，但經過預熱處理后，振蕩搖勻會促使核酸釋放和沉淀搖勻。

[參考文獻]

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[8] 姚懿雯，李冬.Autrax全自動核酸提取工作站對高敏HBVDNA檢測的性能評價[J].國際檢驗醫學雜志，2017，17（23）：3237-3239.

[9] 黎茵.HBV-DNA定量檢測核酸提取過程中影響因素的研究[J].中國保健營養，2016，26（33）：408，409.

（收稿日期：2018-07-28）