膝關節僵硬實驗動物模型的研究進展

陳科，張鑫，劉麗珠，廖瑩瑩

(1.成都體育學院運動醫學與健康學院，四川 成都 610041；2.四川省骨科醫院，四川 成都 610041)

膝關節僵硬臨床較為常見，是膝關節骨折、膝部軟組織損傷、膝骨關節炎或膝關節置換術的常見并發癥[1-2]。膝關節僵硬可嚴重影響患者的日常生活，降低其生活質量。深入研究膝關節僵硬的實驗動物模型，有助于明確膝關節僵硬的發生機制、探索膝關節僵硬的最佳治療方式[3]。目前有關膝關節僵硬實驗動物模型的研究較多，但尚無該模型的統一制備方法及檢測指標。為此，本文對膝關節僵硬實驗動物模型的研究進展進行了綜述。

1 膝關節僵硬實驗動物模型的種類

我們以“膝關節僵硬”“膝關節攣縮”“動物模型”和“traumatic knee contracture”“animal model”“knee stiff”“knee joint stiffness”等為關鍵詞，從中國知網、萬方和PubMed數據庫中檢索了相關文獻，發現多數膝關節僵硬實驗動物模型為大鼠(以SD大鼠居多)和兔(以新西蘭白兔居多)，其次為山羊。

2 膝關節僵硬實驗動物模型的制備方法

2.1 屈曲型膝關節僵硬Salib等[4]選擇新西蘭白兔制備屈曲型膝關節僵硬實驗動物模型：采用吸入異氟醚對新西蘭白兔進行全身麻醉；取膝前正中入路，由髕旁切開進入關節腔，離斷交叉韌帶，先用直徑為3 mm的鉆頭在股骨髁非軟骨處鉆孔造成骨皮質缺損，然后將小腿過度伸展破壞關節囊，最后將膝關節屈曲至150°，并用克氏針固定8周；術后采用丁丙諾啡鎮痛、頭孢唑林抗感染；取出克氏針時，清除關節周圍的異位骨化組織；但實驗過程中是否出現骨折、感染等情況，該研究未報道。Baranowski等[5]選擇大鼠制備屈曲型膝關節僵硬實驗動物模型：先過伸膝關節破壞關節囊，然后于大腿外側和脛骨前內側切開，在脛骨干上斜向上方鉆一個直徑為1.2 mm的孔、在股骨外側髁非軟骨處鉆一個直徑為2 mm的孔(這模擬了膝關節周圍骨折)，注意避免損傷外側副韌帶，最后用克氏針穿透脛骨和股骨，將膝關節固定于屈曲145°位；術后4周膝關節明顯僵硬，術后8周取出內固定物后膝關節活動度未恢復正常；該研究報道了3只大鼠由于麻醉意外或克氏針脫落而被剔除，但未報道大鼠感染情況。

2.2 伸直型膝關節僵硬伸直型膝關節僵硬實驗動物模型的制備方法主要包括非手術方法和手術方法：非手術方法操作簡單，對動物的創傷相對較小，但固定肢體的時間較長；手術方法的優點是能精準控制膝關節固定角度，缺點是操作較為復雜、創傷較大、感染風險較高。無論選擇何種膝關節僵硬實驗動物模型制備方法，關鍵在于保持動物模型的穩定性，即關節功能不會因為時間延長而有較大變化。

2.2.1非手術方法 張理平等[6]采用非手術方法制備伸直型膝關節僵硬實驗動物模型：先對兔膝關節進行強力扭轉、暴力按摩，造成膝關節周圍軟組織損傷，然后將膝關節固定于伸直位4周；但該研究未報道膝關節骨折等情況。周云等[7]先對兔進行全身麻醉，然后將其膝關節置于完全伸直位、踝關節置于跖屈60°位，最后用石膏固定；6周后膝關節攣縮程度趨于穩定。

2.2.2手術方法 黃哲元等[8]選擇山羊制備伸直型膝關節僵硬實驗動物模型：先切斷山羊髕韌帶，顯露股骨遠側干骺端前側，然后屈曲膝關節，顯露關節面，最后用直徑為2 mm的克氏針將膝關節固定于伸直位，并加用石膏固定；術后8周去除石膏及內固定物后，膝關節僵硬程度與術后4周相比無明顯變化，且術側膝關節活動度明顯小于健側。

3 膝關節僵硬實驗動物模型的檢測指標

膝關節僵硬實驗動物模型的檢測指標大致分為兩類：一類為膝關節僵硬的療效指標，主要反映僵硬膝關節的功能等情況；另一類為膝關節僵硬的病理指標，主要反映僵硬膝關節的細胞等病理變化。

3.1 療效指標

3.1.1關節活動度 關節活動度是臨床和科研評價關節功能的基本指標之一。臨床常將膝關節及其周圍肌肉和韌帶組織視為一個整體進行活動度測量，動物實驗可通過切斷膝關節周圍的肌肉和韌帶組織來觀察由關節囊攣縮引起的關節活動受限情況。Trudel等[9]對膝關節僵硬模型大鼠不同時間點的肌源性攣縮及關節源性攣縮情況進行了觀察，發現關節源性攣縮程度隨時間推移而加重、肌源性攣縮程度在膝關節固定2周后逐漸減輕。人體關節活動度的測量，多通過受試者的主觀感受判定關節活動范圍的起止點，而動物關節的活動度則多通過扭矩或力矩等指標反映。Fukui等[10]研究發現，新西蘭白兔的膝關節最大扭矩為0.2 N·m，當牽拉速度為0.4 mm·s-1時可以將慣性的影響降至最低。Steplewski等[11]將角速度設定為40(°)·min-1來減小機械慣性對兔膝關節活動度的影響。Trudel等[12]研究發現，切斷大鼠膝關節周圍肌肉、破壞膝關節囊(伸膝超過0°)后，膝關節的最小力矩為1649 g·cm。

3.1.2關節剛度 關節僵硬是對關節病理狀態的主觀描述，不能反映僵硬關節的生物力學特性。對關節的僵硬程度有一個定量的描述，有利于評價僵硬關節的生物力學特性。“剛度”是指物體在承受外力時抵抗形變的能力，可通過測量關節剛度定量評價關節的力學情況。根據膝關節屈伸僵硬的特點，可將膝關節視為一個力矩模型，膝關節剛度即膝關節最大活動度時膝關節力矩改變量與膝關節活動度改變量之比[13]。Salib等[4]對新西蘭白兔的膝關節剛度進行了測試，關節測試儀的扭矩范圍為0～80 N·cm，以恒定速率逐漸增加扭矩，并測量關節角度的變化，通過軟件繪制成扭矩-關節角度線性圖，其斜率表示關節剛度。Zhou等[3]分別在2.5 N·cm、7.5 N·cm、12.5 N·cm及17.5 N·cm的預定扭矩下牽伸大鼠膝關節，預定扭矩的范圍根據正常大鼠的膝關節力學測試情況制定，2.5 N·cm是剛好高于可測量的阻力點的值、17.5 N·cm是導致關節超過最大伸展角度(180°)和肌橫斷術后關節囊破裂的值；當達到預定扭矩時，測試儀停止2.1 s，記錄關節角度，并制作扭矩-角位移圖，最后根據扭矩-角位移回歸線的斜率來計算關節剛度；該研究發現，大鼠膝關節制動4周時，其制動側的膝關節剛度大于健側和對照組大鼠的膝關節剛度。

3.1.3步態分析 對于膝關節僵硬實驗動物模型，可通過步態分析了解其關節僵硬情況。目前，Catwalk步態分析儀在大鼠的步態分析中較為常用；該儀器主要由玻璃通道、攝像頭、壓力傳感器等組成，大鼠走過玻璃通道時其足印會被通道下方的攝像頭拍攝并傳送至計算機進行分析；為提高正式實驗時采集的數據的有效性，可在正式實驗前增加大鼠走過玻璃通道的次數。Catwalk步態分析儀的分析指標包括靜態指標(足印的面積、長度、寬度等)和動態指標(步速、雙足站立相的持續時間等)，常用步態參數包括步幅、擺動速度、最大接觸面積、平均壓力、支撐相時長等。田海源[14]對膝關節僵硬大鼠進行不同時長的靜態漸進性牽伸，并通過Catwalk步態分析儀對其步態進行分析，結果發現牽伸干預后大鼠的足印面積、足平均壓力、步幅、擺動速度等均較牽伸前增加，其中牽伸時間為30 min組的足平均壓力、步幅和擺動速度優于牽伸時間為20 min組和40 min組；認為適度牽伸可改善膝關節僵硬大鼠的步態，但過長的牽伸時間、過大的牽伸強度，可能造成二次損傷，反而會影響正常步態。

3.2 病理指標

3.2.1肌成纖維細胞數量 肌成纖維細胞是一種特殊的成纖維細胞，關節僵硬被認為與肌成纖維細胞的過度增殖有關。莊澤等[15]研究發現，僵硬關節的肌成纖維細胞中磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)基因轉錄水平下降，可引起PTEN蛋白表達下降，從而激活了下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，促進了肌成纖維細胞增殖，最終導致關節纖維化。α-平滑肌肌動蛋白是肌成纖維細胞的特異性標記蛋白，可以通過免疫組織化學法對該蛋白進行染色從而觀察肌成纖維細胞的數量。Hildebrand等[16]在研究兔膝關節僵硬模型時發現，與正常膝關節相比，創傷、固定4周后的膝關節內肌成纖維細胞數量和肌成纖維細胞占細胞總數的百分比顯著增加。

3.2.2轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達水平 TGF-β是一種多功能細胞因子，可調節多種組織的分化、增殖和細胞外基質的生成。哺乳動物的TGF-β有3種亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是一種普遍存在的纖維化因子，可于組織修復的早期階段大量釋放，在炎癥、創傷修復及纖維化過程中起關鍵作用，被認為是與關節僵硬最相關的因子[17]。周云等[7]研究發現，隨著兔膝關節固定時間的延長，其關節液及關節囊中TGF-β1水平逐漸增高。Monument等[18]研究發現，膝關節僵硬兔的關節囊內TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平均高于對照組。

3.2.3Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量 Ⅰ型和Ⅲ型膠原是形成膠原纖維的主要成分，膠原纖維雖然可以促進傷口愈合，但若過度沉積，則可引起關節纖維化，造成關節僵硬。Sasabe等[19]研究發現，與空白對照組相比，觀察組大鼠的膝關節在固定1周后Ⅰ型膠原含量增加、固定2周后Ⅰ型膠原密度增加。Li等[20]研究發現，關節僵硬大鼠的滑膜組織中Ⅲ型膠原mRNA水平明顯高于正常對照組，據此推測滑膜組織膠原代謝異常與骨折后關節僵硬的發生有關。Steplewski等[21]采用IgG重組抗體變體治療兔膝關節僵硬，結果發現在治療2周后，與對照組相比，關節僵硬組兔膝關節內Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原含量的比值降低，認為抑制膠原纖維的形成可以緩解關節攣縮程度。

3.2.4基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達水平 MMP主要由巨噬細胞、中性粒細胞及內皮細胞等產生，是一類結構中含有Zn2+、Ca2+的蛋白水解酶[22]。目前發現的MMP根據其作用底物可分為6類，即膠原酶、明膠酶、間質溶解素、基質溶解因子、膜型基質金屬蛋白酶、其他，其中膠原酶的主要作用底物是纖維類膠原蛋白(即Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)、明膠酶的主要作用底物是Ⅸ型膠原蛋白(參與結締組織代謝)[23]。Sun等[24]研究發現，與采用慢病毒介導細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)2小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)治療的關節僵硬治療組大鼠相比，關節僵硬組大鼠的MMP-1和MMP-13表達顯著增加，由此認為慢病毒介導ERK2-siRNA可在一定程度上減輕創傷后關節囊過度纖維化。

3.2.5組織形態變化 Chen等[25-26]研究發現，僵硬關節的主要病理改變為纖維及滑膜組織增生或局部退變，部分纖維組織可出現增生伴玻璃樣變性，滑膜下纖維組織中可見血管增生。Watanabe等[27]用石膏將大鼠膝關節固定制備膝關節僵硬模型，并對不同固定時間的膝關節組織形態變化進行了觀察：固定2周時，可見膝關節周圍脂肪組織萎縮；固定4周時，可見膝關節軟骨與鄰近組織粘連；固定16周時，可見脛骨和股骨與其臨近組織粘連；固定32周時，可見膝關節囊纖維化、關節腔變窄、關節及其周圍組織僵硬。Salib等[4]研究發現，與膝關節腔注射安慰劑組相比，膝關節腔注射塞來昔布可以改善關節僵硬組新西蘭白兔膝關節囊內致密纖維結締組織。

4 小 結

制備一種有效且穩定的膝關節僵硬實驗動物模型，對人類認識和防治膝關節僵硬具有重要價值。在所有膝關節僵硬類型中，以伸直型膝關節僵硬最為常見，因此應積極探索該類型動物模型的制備方法及相關檢測指標。可用于評價膝關節僵硬的指標較多，除了肌成纖維細胞數量、TGF-β表達水平、Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量、MMP表達水平及組織形態變化外，還包括結締組織生長因子、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6及纖維連接蛋白表達水平等。