慢性脊髓損傷動物模型的研究進展

李瑋農，趙繼榮，鄧強，朱換平，陳文，陳祁青，趙寧，朱寶，楊濤，張立存

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050)

慢性脊髓損傷(chronic spinal cord injury，CSCI)是由于椎間盤突出、骨贅形成、后縱韌帶骨化、黃韌帶肥厚、脊柱畸形、腫瘤等多種原因導致椎管及神經根管容積減小，漸進性壓迫脊髓及其附屬結構，進而導致損傷節段出現各種感覺和運動異常、括約肌功能障礙、肌張力異常及病理反射等相應改變的一種損傷。CSCI的病理過程廣泛存在于脊髓型頸椎病、后縱韌帶骨化和椎管狹窄等多種疾病的病程中[1]。CSCI早期起病隱匿，癥狀不典型，容易被忽視；在疾病后期，隨著脊髓長期受壓，可造成脊髓功能不可逆性損傷，致殘率較高。雖然醫學界很早就開始關注并研究CSCI，但由于難以復制出與人類CSCI病理進程相似的動物模型，限制了人們對該病的認識和診療水平。本文從CSCI模型動物選擇和CSCI動物模型構建2個方面對CSCI動物模型的研究進展進行了綜述，現總結報告如下。

1 CSCI模型動物選擇

建立理想的動物模型是開展CSCI相關研究的前提條件，而選擇的實驗動物尤為重要。理想的CSCI實驗動物應具備以下特點：①發病過程及組織病理學變化與人類相似；②實驗操作方便；③耐受損傷的能力強。

目前在CSCI的相關基礎研究中常選用中小型動物，如兔、大鼠及小鼠等[1-3]。兔的神經系統較發達，價格相對便宜，容易獲得，且耐受損傷能力強，是目前應用較多的CSCI模型動物，被很多研究者應用于CSCI的實驗研究中[4-5]。大鼠來源充足，價格較低，容易喂養和護理，而且解剖操作方便、對疾病抵抗力強，其中應用較多的是Sprague-Dawley大鼠和Wistar大鼠[6]。但大鼠的椎管周徑小、脊髓較細，實驗操作中容易誤傷脊髓。小鼠與人類有著較高的基因同源性，加之損傷后的行為學評估方法較為成熟，尤其是小鼠具有獨特的轉基因優勢，使其更適用于基因干預的實驗研究。近年來，隨著轉基因技術的發展，科學家們培養出了一種隨著年齡增長出現頸椎椎體鈣化沉積物增多的小鼠——Twy(tiptoe-walking Yoshimura)小鼠，被認為是目前僅有的無創慢性進行性動物脊髓壓迫模型動物[7]。但小鼠體形小，脊髓較大鼠更細，不利于實驗操作。

從方便實驗操作及獲得實驗結果的角度來講，羊、豬、犬等大型動物不失為更好的選擇。它們的神經系統結構、組織器官構造以及損傷后的癥狀都與人類有著很高的相似性，在脊髓損傷機制研究以及后期藥物應用的評估方面都是很好的選擇[8]。但這些動物對飼養環境要求高、價格較貴，很難普遍應用于實驗室CSCI研究的初期試驗。而與人類在解剖結構、生理病理和代謝機能方面最為相似的靈長類動物，因較為稀少、價格昂貴且涉及道德倫理等原因，在研究中也未能普遍應用[9]。

2 CSCI動物模型構建

雖然研究者們都在盡量探索與人類CSCI病理進程相似、易于推廣的標準化CSCI動物模型構建方法，但目前還沒有任何一種模型能完全模擬出人類CSCI的病理進程。理想的CSCI動物模型應具備以下特點：①臨床相似性。動物模型的病理進程與CSCI相似，能反映脊髓受損后的病理變化和運動行為改變情況。②可調控性。能根據實驗需要，準確調節損傷的進程和強度，達到慢性、漸進性損傷的要求。③可復制性。動物模型的制作技術和設備要求適中、動物死亡率低、實驗可重復性好，從而可以快速大批量制作。

目前國內外較為成熟的CSCI動物模型有球囊壓迫模型、螺釘壓迫模型、骨粒回植誘導骨贅壓迫模型、硅膠片壓迫模型、腫瘤壓迫模型、可膨脹材料壓迫模型、Twy小鼠模型等[10-12]。

2.1 球囊壓迫模型球囊壓迫法可調控性較強，被廣泛應用于脊髓損傷的實驗研究中。Tralov等[13]于1953年用犬建立了最早的可充氣式球囊壓迫模型，他們通過手術將球囊植入實驗動物椎管內，待麻醉恢復后，通過擰緊螺釘使硬脊膜外氣囊充氣壓迫脊髓，形成血流供給障礙，造成脊髓組織缺血缺氧，進而導致脊髓組織變性壞死。這種模型中脊髓損傷的程度主要取決于球囊提供的壓力大小和脊髓受壓時間的長短。由于氣囊膨脹時囊內壓力并非呈線性增加，且反復充氣對脊髓的反復刺激容易造成急性及亞急性損傷，難以完全模擬CSCI的病理進程。楊詩球等[14]對這一模型進行了改進，他們自大鼠胸椎椎弓根處向椎管內鉆一小圓孔，通過圓孔將1個水囊放置在硬脊膜囊外，用骨臘封閉圓孔后向水囊內注入不同劑量的泛影葡胺使水囊膨脹壓迫脊髓。但這種改進后的水囊壓迫模型也未能解決球囊膨脹時非線性壓迫的弊端，只是通過注入不同劑量的液體控制了椎管狹窄的程度。

2.2 螺釘壓迫模型Hukuda等[15]于1972年選擇犬作為模型動物，通過頸前路手術將螺釘置于犬頸椎椎體中，并在體外留一旋轉柄，通過旋轉柄緩慢將螺釘推進到椎管內，以造成頸脊髓慢性壓迫。這種造模方式能較好地控制脊髓損傷的進程和強度，被廣泛應用于脊髓損傷的動物實驗中。但這種直接的螺釘壓迫常導致脊髓直接性損傷，易造成實驗動物癱瘓及死亡，且金屬螺釘在MRI檢查時會出現偽影，不利于實驗效果的評價。為解決這一問題，Xu等[16]將特殊設計的固定裝置固定在大鼠T7～T9脊椎上，自T8椎板開窗放置1塊塑料板，通過旋轉螺釘推擠塑料板對脊髓進行緩慢間接的壓迫，持續6周，期間每周通過影像學檢查對壓縮裝置的放置位置和脊髓的受壓程度進行觀察，并計算大鼠的運動感覺缺陷指數，6周后收集受壓的T7～T9脊髓進行組織學檢查。這種改進后的裝置通過對脊髓的漸進性壓迫，成功誘發了大鼠運動和感覺功能紊亂。該模型通過在硬脊膜外使用塑料板，避免了螺釘直接損傷脊髓，可以較好地控制壓迫程度，形成CSCI。這種造模方式的弊端在于塑料墊片在X線檢查時不顯影，擰入螺釘過程中不易評價螺釘、墊片與脊髓之間的位置關系。趙鵬等[17]也采用與Xu等[16]相似的裝置進行CSCI造模，但將塑料墊片改為鋼板，證實了該裝置及所制作的動物模型的穩定性和可靠性。如何消除或減少急性損傷導致的動物癱瘓和死亡，是應用此類方法造模的關鍵[18]。

2.3 骨粒回植誘導骨贅壓迫模型周磊等[19]切除大鼠L5棘突，切除部分椎板形成3 mm×15 mm的缺損，將切取的骨塊制成直徑0.5 mm的碎骨粒，回植于切取骨塊處(實驗組)，對照組僅切除L5棘突及同體積椎板；術后實驗組大鼠下肢運動功能評分較術前減小，術后16周時實驗組大鼠出現明顯的間歇性跛行；病理檢查發現，術后10周時實驗組大鼠出現明顯椎管狹窄，瘢痕組織與硬脊膜囊粘連明顯，再生椎板基本形成；影像學檢查發現，術后1周時實驗組大鼠L5椎管橫截面積較對照組減小16.1%。由于碎骨粒誘導椎板再生而導致椎管狹窄的過程是慢性進行性的，所以不會對脊髓造成急性壓迫和損害，是對CSCI病理進程的良好模擬，理論上是一種既簡單又理想的造模方法。陳振南等[20]在新西蘭兔L5左側椎板開窗，將碎骨粒鑲嵌于醫用膠原蛋白海綿上，放置于椎板開窗處，也成功復制了CSCI模型。這種造模方式的優點在于：①造模后隨著瘢痕組織形成，瘢痕組織與硬脊膜囊粘連，可對脊髓組織形成自外向內的慢性壓迫，能很好地模擬CSCI的病理進程；②操作簡便安全，動物成活率高；③模型制作周期短，一般12～16周即可完成。其缺點包括：①大鼠、小鼠等小型動物的椎板較小，實驗操作難度大，實際中多選用大中型動物，導致實驗成本增加；②椎板開窗后將自體骨植入到較小的手術操作區域，由于椎板有一定的再生能力，能很快重新形成硬脊膜后方的骨性屏障，有可能達不到對脊髓組織的持續壓迫。

2.4 硅膠片壓迫模型1999年Yamaguchi 等[21]通過在大鼠椎管內放置硅膠片成功制作了CSCI模型，組織學檢查顯示整個實驗過程中大鼠脊髓組織軸突持續變性和再生。國內學者劉學勇等[22]將特制的硅膠片分別插入大鼠L4和L6椎管，造成橫截面積各縮小30%的雙節段椎管狹窄，制成雙節段CSCI模型；并進行高頻率刺激和追加壓迫，觀察不同刺激條件和壓力下受壓馬尾神經的復合動作電位和復合感覺神經動作電位的變化情況，發現動態負荷使受壓的馬尾神經動作電位發生一過性降低。代鳳雷等[23]通過手術將自制的硅膠片放置于大鼠L4、L5椎板下，術后大鼠的平板運動距離較造模前明顯減小，CT檢查顯示實驗部位椎管內密度值較正常椎管內密度值明顯升高；進一步的三維有限元建模結果顯示大鼠椎管內徑較正常大鼠明顯狹窄；解剖后發現大鼠受壓節段的馬尾神經受壓達50%～70%。硅膠片壓迫造模的優點是：①硅膠植入造成的CSCI病理過程與人體椎管狹窄導致的CSCI病理過程相似，均屬于致壓物壓迫脊髓及其附屬結構產生相應癥狀；②所采用的醫用硅膠具有較好的組織相容性，免疫反應小，且價格較低；③實驗者可以選擇不同規格的硅膠片植入椎管的不同部位，造成相應部位脊髓損傷。但這種造模方式在實際操作中很難掌握脊髓壓迫的程度，存在造成急性、亞急性脊髓損傷的可能。總體來說，該模型符合目前學術界對于CSCI病理進程的認識。

2.5 腫瘤壓迫模型腫瘤壓迫模型是通過各種途徑將腫瘤組織植入到動物硬脊膜外，借助腫瘤組織在硬脊膜外腔的緩慢浸潤生長，逐漸對脊髓組織產生壓迫的一種模型。Fu等[24]將腫瘤組織種植于大鼠T9節段的硬脊膜外間隙，實驗動物在術后18.8 d(平均)時出現了神經損害表現。2013年，Sarabia-Estrada等[25]在一項觀察前列腺癌轉移至脊柱的試驗中，將人前列腺腫瘤細胞PC3通過注射方式植入到雄性無胸腺大鼠(5周齡)的L5椎體，使用視頻監控觀察動物步態變化，發現在植入腫瘤組織后第20天(平均)大鼠出現明顯的步態障礙體征(拖曳尾巴，后肢肢體不協調等)，第22天處死大鼠解剖后觀察到大鼠椎體及周圍組織均顯示出腫瘤浸潤生長的跡象并壓迫脊髓組織，病理檢查發現其脊髓周圍腫瘤組織與植入的前列腺癌腫瘤組織一致。這種造模方法的局限性在于：①可用于實驗的腫瘤組織來源困難，取材、制備和保存要求高，目前應用較多的有肝癌組織、前列腺癌組織和乳腺癌組織；②腫瘤組織的植入方式和位置無統一標準，且生長浸潤方向無法人為控制，對脊髓組織形成壓迫的程度也不一致，實驗結果的可控性和實驗的可重復性較差；③腫瘤細胞在動物體內生長機制復雜，易造成重要臟器損傷，影響動物壽命，導致樣本丟失嚴重；④腫瘤組織生長速度快，容易對脊髓形成急性及亞急性損傷。由于存在這些問題，目前在CSCI實驗研究中，該模型已很少被應用。

2.6 可膨脹材料壓迫模型1989年，Arbit等[26]首次將一種遇水可膨脹材料(甲基纖維素-聚丙烯腈)植入動物硬脊膜外，制成CSCI模型。此后，這種造模方式在脊髓損傷的實驗研究中多有應用。2013年，Long等[27]將一塊吸水后可膨脹聚氨酯薄板(規格為1 mm×3 mm×1 mm，能在2 h內吸收椎管內液體，使體積增大為原來的7倍)植入大鼠C6椎板和硬脊膜之間，利用其在硬脊膜外吸水后的膨脹力對脊髓形成直接壓迫。由于材料膨脹速度過快，容易造成脊髓組織急性或亞急性損傷，該模型不完全符合CSCI慢性壓迫的損傷機制。2016年，李金軒[28]采用醫用甲基乙烯基硅橡膠進行CSCI造模，這種材料的吸水成分為交聯聚乙烯基毗咯烷酮水凝膠，這種材料在吸水性和保水性方面具有較強的穩定性，吸水后體積近似均勻增長，7 d后體積增大為原來的2.92倍；實驗中他們將規格為3 mm×1.5 mm×1.2 mm的壓迫材料放置在大鼠C6～C7硬脊膜外，術后觀察大鼠脊髓慢性受壓后的病理變化，證實了應用吸水性和保水性方面更穩定的材料能更好地模擬CSCI慢性漸進性的損傷特點。可膨脹材料壓迫模型的優點是：①手術操作簡單，一次手術就可完成造模操作；②感染率較低，動物成活率較高，樣本量丟失較少；③材料膨脹時可形成對脊髓的均勻壓迫，較為符合CSCI的病理特征。不同材料內植物遇水膨脹的速度以及持續時間差別較大，而且難以人為控制，因此這種造模方法也容易形成急性或亞急性脊髓損傷，影響實驗效果。相信隨著材料工藝和技術的不斷進步，這種造模方式將會成為理想的CSCI造模方法。

2.7 Twy小鼠模型1981年，Hosoda等[29]培育出一種轉基因小鼠，這種小鼠與異質結合體的同胞小鼠產生的后代具有常染色體隱性遺傳病，隨著年齡增長，會在其頸椎后出現鈣化物沉積，逐漸造成頸脊髓壓迫，因其特征性的踮腳爬行方式，故被命名為Twy小鼠。Yato等[30]利用Twy小鼠證實了中度慢性脊髓壓迫(20%<占位率<30%)并不會引起脊髓組織結構性改變，而是導致脊髓運動神經元功能改變。Song等[31]利用Twy小鼠研究發現，絲裂原活化蛋白激酶2信號通路參與慢性壓迫性頸脊髓損傷的炎癥反應，抑制絲裂原活化蛋白激酶2能減輕頸脊髓炎癥反應，從而抑制頸脊髓細胞凋亡，使神經功能障礙得到顯著改善。Twy小鼠模型目前被廣泛應用于CSCI的實驗研究中，但該模型存在壓迫過程中不能控制壓迫程度，且無法重復實驗結果的弊端。

3 小 結

在CSCI模型動物的選擇上，大鼠因具有容易獲取、生長周期短、抗感染能力強等優點，成為眾多CSCI造模方式中首選的模型動物。球囊壓迫模型、螺釘壓迫模型、骨粒回植誘導骨贅壓迫模型、硅膠片壓迫模型、腫瘤壓迫模型、可膨脹材料壓迫模型及Twy小鼠模型等均為目前國內外較為成熟的CSCI動物模型，但尚無一種模型被學界公認。CSCI的發病原因多樣、機制復雜，根據不同的發病原因所建立的模型，其病程進展不盡相同，而采用不同的動物、造模機制所建立的模型又有其各自的特點，所以在選擇CSCI動物模型時，應根據實驗需要，選擇與之相適應的CSCI實驗動物和造模方式。建立一種具有高度可重復性和穩定性，能客觀、準確、定量模擬出與人類CSCI病理進程類似的動物模型還有一定困難，還需在前期研究的基礎上不斷完善。