miRNA對畜禽肌肉生長發育調控的研究進展

胡志剛，曹俊婷，張建勤，張慧林，劉小林

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

骨骼肌占脊椎動物體質量的40%～60%，對機體運動和代謝平衡很重要。肉類產量和質量是畜禽養殖業考慮的重要因素。隨著人們對肉產品需求的不斷增加，畜禽的研究主要集中在提高肌肉生長速度、肌肉質量和產量等方面。除營養和環境因素外，畜禽的遺傳也是決定骨骼肌生長發育的重要因素。在肌肉形成的過程中，肌源性前體細胞遷移到肌肉形成的適當部位(如四肢)后開始增殖。之后肌肉前體細胞退出細胞周期，融合形成肌管進而形成多核肌纖維。動物肌肉產量在很大程度上取決于肌纖維的增生和肥大，而這些復雜的發育過程依賴于精確的時空網絡，該網絡在多個水平上調控轉錄因子，包括mRNA的轉錄和翻譯、蛋白質的穩定性和降解等。MicroRNA(miRNA)參與生物發育和代謝的各個方面，包括細胞增殖、分化、凋亡等發育調控機制。miRNA通過識別位于靶mRNA的3′非翻譯區(3′ UTR)中的特異性互補序列，在很大程度上抑制轉錄后的基因表達(包括mRNA降解，抑制翻譯起始和延伸)[1]。

1 肌肉的形成機制

骨骼肌起源于哺乳動物和鳥類的肌節。早期的胚胎肌纖維形成發生在不同的階段，即脊椎動物要經歷3次肌生成(胚胎期、胎兒期和成年期)，才能形成最終成熟的肌肉。胚胎期肌生成產生身體的第1個肌肉纖維(初級纖維)，其作用是定義肌肉的類型、形狀或位置，但不決定肌肉質量。在胎兒期肌生成過程中，胎兒成肌細胞融合并產生圍繞初級纖維的次級纖維(胎兒纖維)。次級纖維的形成對成熟肌肉中肌纖維的數量有很大的影響[2]。成年期的肌發生過程與肌肉再生有關，即在沒有損傷的情況下，個體在出生后不會形成新的肌纖維，肌肉質量的增加主要是由于肌纖維變粗變長所致[3]。位于肌纖維基膜和質膜之間的肌源性細胞，即衛星細胞(satellite cells,SCs)，是動物出生后影響肌肉肥大和再生的主要因素。

骨骼肌的形成和再生是一個復雜且受調控的過程，涉及肌肉前體細胞的激活、增殖和分化，并且肌生成過程受到生長因子和轉錄因子的時空調控。肌肉祖細胞定向分化為成肌細胞的過程，需要經過增殖、分化并融合形成多核肌管，最終形成成熟的肌纖維。生肌調節因子家族(MRFs)主要調控成肌細胞的增殖和分化，最終形成成熟的骨骼肌細胞。在肌肉成熟后，肌肉祖細胞進入靜止期，形成SCs。肌肉祖細胞的特征是表達Pax3(paired box 3)和Pax7(paired box 7)，其中Pax3調控MRFs的轉錄，并在胚胎發育早期促進細胞向成肌細胞分化[4]。Pax7是動物出生后肌肉發育的標記基因，通過與細胞生長，黏附等相關的特定基因結合而促進細胞增殖并抑制其分化。在胚胎期，Pax7參與SCs的增殖并將其融合為肌管，同時也促進動物出生后肌纖維的肥大。畜禽出生后肌纖維的數目不再增加，但肌纖維會變粗增長，這是DNA轉錄和翻譯增加的直接結果，即蛋白質合成的增加。為了獲得更多蛋白質合成，就要求細胞核數量增多，此時位于肌纖維細胞膜和基膜之間的SCs發揮了重要作用。SCs分裂后與相鄰的肌纖維相互融合，提供細胞核。當蛋白質合成率高于降解率時，就會導致肌纖維的肥大，從而增加肌肉的產量。

2 miRNA作用機制

miRNA是單鏈非編碼RNA，在轉錄后負調控基因的表達。miRNA最初由RNA聚合酶II轉錄為長的初級pri-miRNA轉錄物，然后通過包含Drosha和DGCR8/Pasha的多蛋白復合物處理形成具有莖環結構的前體pre-miRNA。pre-miRNA被核輸出因子Exportin 5轉運至細胞質中，由RNase Dicer裂解成約22 nt的雙鏈miRNA中介體。隨后其中1條鏈在解旋酶的作用下解鏈，最終形成單鏈的miRNA。miRNA分子與Argonaute蛋白結合形成RNA誘導沉默復合物(RISC)，沉默特定的miRNA靶基因。基因沉默是由堿基配對產生的，即miRNA與靶基因的作用大多是靶向作用在目標基因的3′UTR上，引起下游基因的翻譯抑制(不完全匹配)或使靶mRNA降解(完全配對)[5]。

3 miRNA對畜禽肌肉生長發育的調控

在胚胎期肌生成過程中，Dicer的特異性失活會引起圍產期致死率、肌肉質量降低和肌纖維形態異常，這使得miRNA成為胚胎肌肉發育的關鍵調控因子[6]。3種肌肉特異性miRNA：miR-1、miR-133和miR-206在調節肌生成過程中起著關鍵作用。miR-1和miR-133聚集在同一個染色體位點上并一起轉錄，進一步加工會產生2個獨立成熟的miRNA，但它們在骨骼肌增殖和分化中的作用截然不同。miR-133通過抑制血清反應因子(SRF)促進成肌細胞增殖，而miR-1通過靶向抑制組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)促進肌生成[7]。miR-206還通過靶向抑制DNA聚合酶α亞基(Pola1)、連接蛋白43(Cx43)、卵泡抑素樣1(Fstl1)和促性腺激素(Utrn)的表達來抑制DNA的合成，促進細胞周期的退出和最終肌細胞的分化[8-10]。miR-181通過靶向成肌細胞終末分化的抑制因子Hox-A11，參與MyoD的誘導和肌肉標志物的表達[11]。此外，miR-214、miR-208、miR-195和miR-29等在肌肉中特異性、非特異性或暫時性表達，并參與骨骼肌或心肌細胞的增殖或分化[12-15]。同樣，miR-26a、miR-322、miR-424、miR-378、miR-486和miR-503能加速成肌細胞肌管的形成和肌源性標記物的表達。目前，隨著高通量測序技術的廣泛應用，越來越多的畜禽骨骼肌miRNA及其下游靶基因被鑒定出來，并從個體或細胞水平研究其功能。

3.1 miRNA調控家畜肌肉生長發育miR-133和miR-206作為最常見的調控肌肉生長發育的miRNA，其調控作用已在牛肌肉中得到證實。研究發現miR-133b能促進牛骨骼肌SCs的增殖[16]，而miR-206對牛骨骼肌SCs有促進分化的作用[17]。在多種組織中都廣泛表達的miR-181a能促進牛骨骼肌SCs的分化[18]。miR-2425靶向調節RAD9A和MYOG，進而促進牛骨骼肌SCs的增殖，并抑制其分化[19]。此外，魏雪峰[20]研究發現，miR-378a-3p通過靶向HDAC4來調控牛肌細胞的增殖、分化及凋亡；miR-107通過調控靶基因Wnt3a來抑制牛肌細胞的增殖和分化。張偉偉[21]構建了不同階段牛骨骼肌SCs分化的差異miRNA表達譜，發現靶向調控MyoG基因的miRNA有65個，其中miR-2400是牛中特異表達的miRNA，其負調節MyoG的表達，促進骨骼肌SCs的增殖。王軼敏[22]篩選得到15個牛肌肉SCs成肌分化過程中顯著差異表達的miRNA，其中miR-1、miR-206、miR-128、miR-133a、miR-133b、miR-143、miR-145、miR-193b、miR-139、miR-378、miR-378b、miR-378c上調表達，miR-222、mi R-335和miR-376e下調表達。孫加節[23]利用深度測序的方法鑒定了胚胎期90，200 d，出生后5 d，12月齡及24月齡秦川牛背部肌肉miRNA表達規律，共發現510個miRNA，其中有263個miRNA在5個時期都表達；同時在秦川牛肌肉組織中共預測得到125個新的miRNA，其中4個在5個時期中都表達。有14個miRNA在出生后肌肉組織中的表達顯著上調，而有22個miRNA在出生前肌肉組織中的表達顯著上調。

有研究表明，miR-1和miR-133在山羊心臟和背最長肌中高表達，在其他組織中低表達。并且山羊骨骼肌中miR-1的表達隨著個體的發育開始減少，而miR-133的表達則顯著增加。此外，miR-1和miR-133通過負調控靶基因HDAC4和SRF對山羊骨骼肌發育進行調控[24-25]。宋廣超等[26]研究了miR-133前體在不同綿羊骨骼肌中的多態性，結果發現綿羊miR-133前體序列的SNP(g.54047535)位點可能影響miR-133前體的加工和成熟，從而影響綿羊的產肉性能。為研究綿羊骨骼肌中miRNA的表達情況，ZHAO等[27]在綿羊骨骼肌中檢測到2 396 個miRNA。其中，miR-192的過表達能顯著抑制SCs的肌源性分化，促進SCs的增殖。相反，抑制miR-192的表達則促進SCs的分化并抑制SCs的增殖。此外，miR-192靶向視網膜母細胞瘤1(RB1)起作用，而RB1是一種已知的肌生成調節因子。

楊雪梅等[28]探究miRNA與豬肌肉品質的調控關系，研究結果表明miR-1、miR-27a、miR-369、miR-378在藏豬、成華豬、雅南豬、丫杈豬、青峪豬、內江豬和烏金豬背最長肌中的表達相似，4種miRNA均正調控豬肉品質，負調控豬胴體品質。劉曉琴[29]研究發現miR-378通過抑制BMP2和MAPK1的表達來調控豬骨骼肌的生長發育。王曉燕[30]的研究證實miR-499-5P能抑制Sox6的表達，從而調節豬骨骼肌慢肌纖維的形成。與此相同的是，miR-208b和miR-499已被證實具有促進氧化型肌纖維的形成，抑制酵解型肌纖維形成的作用[31]。王言等[32]研究了miRNA的表達與豬背最長肌肉質風味的相關性，發現miR-23a、miR-151與豬肉品質正相關，而miR-199a、miR-299和miR-497與豬胴體品質正相關。目前，通過高通量測序鑒定出越來越多豬肌肉發育相關的miRNA，不僅豐富了豬肌肉miRNA數據庫，也為深入了解其功能提供了研究基礎。不同豬種間miRNA的表達存在差異，SHENG等[33]分析了大白豬和民豬在出生后60，120，150，180 和210 d背最長肌的miRNA，共鑒定出734個miRNA，包括308個有注釋的miRNA和426個新的miRNA，其中307個miRNA被認為是豬特有的。孫瑞萍等[34]比較分析了1月齡五指山豬與長白豬骨骼肌的miRNA，共獲得318個己知豬的miRNA，其中五指山豬鑒定出312個已知 miRNA和83 個新的miRNA，長白豬鑒定出306個已知 miRNA和88個新的miRNA。此外，發現的17個差異顯著的miRNA中16個miRNA表達上調，1個miRNA表達下調。

3.2 miRNA對家禽肌肉生長發育的調控let-7在組織器官發育中具有重要的調控作用。岳孝亭等[35]發現let-7b通過靶向調控IGF2BP3的表達來影響IGF2的轉運、穩定和遷移，進而影響雞成肌細胞的增殖。LUO等[36]研究結果表明miR-203在第10～16天(E10～E16)的雞胚骨骼肌中會短暫上調，而在E16之后miR-203的表達急劇下調甚至不表達。此外，miR-203的過表達會抑制成肌細胞的增殖和分化，而其功能的喪失則促進了成肌細胞的增殖和分化。c-JUN和MEF2C對細胞增殖和肌肉發育起重要作用，在肌生成過程中，miR-203可以靶向并抑制c-JUN和MEF2C的表達。有研究表明gga-miR-206在金茅黑雞肌肉發育中是顯著上調基因。婁秋宏[37]研究表明金茅黑雞腿肌中gga-miR-206的表達呈先升后降的趨勢，在胚胎第16天時達到頂點，隨后開始下降并在出生后又有所回升；胸肌中gga-miR-206的表達呈現下降趨勢，在胚胎第10天時表達量達到最高，并在第16天時出現一個小高峰。為進一步探尋蛋雞和肉雞miRNA的表達差異，LI等[38]對肉雞和蛋雞骨骼肌進行了轉錄組分析，共鑒定了33個新的和189個已知的雞miRNA。其中17個miRNA在肉雞和蛋雞之間存在差異表達，且這些miRNA的許多靶點與肌生成調控有關。WATCHARAPONG等[39]研究發現，與對照組(37.8℃)相比，在38.8℃條件下，胚胎期第7～10天雞胸肌中miR-133的上調以及腿肌中miR-199a-5p、miR-1915和miR-638的下調在功能上與肌生成和體型有關。雞胚胎期第10～13天，在36.8℃下孵化會導致與增殖和分化相關的let-7、miR-93和miR-130c的下調。高劍[40]發現miRNA的表達數目在藏雞胚胎期隨時間而逐漸遞減，出殼后miRNA的表達數目趨于平穩。

不同生長階段鴨肌肉的miRNA數量存在差異。GU等[41]分析了胚胎第13，19和27天北京鴨胸肌中miRNA的分布，共獲得382個miRNA，包括359個已鑒定的miRNA和23個新的miRNA，并且發現北京鴨miRNA高度保守。let-7參與細胞的生長、分化和凋亡，徐鐵山等[42]研究發現let-7-5p在北京鴨孵化第11～27天胸肌中的表達逐漸增加，其靶基因GO中的許多條目與骨骼肌發育密切相關。李欣欣[43]的研究表明miR-33a能通過靶向調控IGF-1、FST和CCND1的表達以及PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制鴨成肌細胞增殖。吳寧昭[44]研究發現miR-1通過靶向調控HDAC4來促進鴨成肌細胞的分化，miR-133則通過調節SRF、TGFBR1的表達來促進鴨成肌細胞増殖。

3.3 miRNA對水產動物肌肉生長發育的調控miRNA對水產動物肌肉生長發育具有重要的調控作用。miR-1和miR-133能促進斑馬魚肌肉基因的表達并調節肌節肌動蛋白[45]。DURAN等[46]的研究結果表明miR-1和miR-206調控Pacu(一種魚類)成肌細胞的分化，而miR-133調控這些細胞的增殖。miR-499在慢肌肌肉中高度表達，表明其參與了慢肌肌纖維表型的鑒定。YAN等[47]在鯉魚骨骼肌中鑒定出188個保守的miRNA和7個新的miRNA，其中miR-1、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-133a-3p、miR-206、miR-214和miR-222在鯉魚骨骼肌發育過程中差異表達。CHU等[48]和張方亮[49]從中國鱸魚和鱖魚慢肌和快肌中分別篩選得到199和59個差異表達的miRNA，其中miR-103和miR-144分別負調控快肌和慢肌中SmyD1a和SmyD1b的表達，從而影響中國鱸魚和鱖魚肌肉的發育和性能。ZHAO等[50]研究發現miR-181b-5p通過降低羅非魚MSTNb的表達來促進骨骼肌的生長。

4 展望

miRNA可以通過介導mRNA的降解或抑制翻譯來調控靶基因的表達，已成為調節基因表達的重要參與者。在肌肉發育方面，miRNAs通過調控靶基因的表達來調節肌細胞生物學的重要過程，包括細胞增殖、分化、干細胞更新和維持等。盡管在過去的十幾年中關于miRNA已經取得了許多重要的發現，但是由于轉錄因子、miRNA和它們的靶基因之間存在多種可能的相互作用，目前對miRNA在動物肌肉生長發育中的作用的認識仍然相當有限。未來的研究需要集中于鑒定、表征miRNA在脊椎動物肌肉發育功能，預測和驗證其下游的靶基因，研究其具體的作用機制和相關信號通路。隨著對miRNA研究的深入，對定向提高家養動物肌肉產量、生長發育速度和肉品質質量方面有著十分重要的意義。