慢病毒載體系統研究及應用進展

張 慧，曹勝亮，劉思當

(山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

慢病毒(lentivirus)是一種具有特殊性質的病毒，致病過程緩慢，能將自身致病基因整合到宿主基因組中，且在宿主表現臨床癥狀前能潛伏感染數年之久。科研人員利用這種天然優勢，開發了慢病毒載體(lentiviral victors，LVs)。慢病毒載體是一種經過基因改造的病毒載體，在剔除慢病毒致病因子的同時，保留其基因組能整合到宿主基因組的能力，可攜帶各種外源性基因或改造基因整合至宿主染色體中達到穩定表達的目的[1]。最初慢病毒多感染淋巴細胞、巨噬細胞，現經改造后可感染神經細胞、肝細胞、腦細胞等多種組織細胞。目前，慢病毒載體作為生物疾病研究中的重要載體，被廣泛運用在腫瘤治療、基因調控、通路研究、免疫等各個領域。

1 慢病毒載體分類及結構組成

1.1 慢病毒載體分類目前使用的慢病毒載體屬于逆轉錄病毒家族，包括早期的人Ⅰ型、Ⅱ 型免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ、HIV-Ⅱ)載體，以及后期不同種屬的猿類免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)載體、貓免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus,FIV)載體、馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)載體、山羊類關節炎-腦炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)載體、牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency birus,BIV)載體等。不同種屬載體的出現意味著針對相應動物疾病的研究增加了更多選擇，也能有效提高感染效率和成功率。

1.2 慢病毒基因組結構慢病毒基因組結構與逆轉錄病毒的基本結構組成相同，包括gag、pol、env基因及3′和5′LTR，其中gag編碼核心結構蛋白，pol編碼整合到宿主細胞基因組過程中所需的酶，env編碼包膜蛋白，LTR包含順式作用元件及病毒包裝信號[2]。以應用最早、最廣泛的HIV載體為例， HIV核心蛋白由gag和pol基因編碼，gag編碼病毒衣殼(CA)、病毒基質(MA)、病毒核衣殼(NC)，pol編碼蛋白則水解成3種病毒酶：蛋白酶(PR)、病毒逆轉錄酶(RT)和病毒整合酶(IN)，共同構成病毒核心成分。env基因編碼gp160前體蛋白，被加工切割為gp120亞基和gp40三聚體，構成病毒的脂質外膜衣殼。在許多情況下，在載體中env基因編碼蛋白功能會被另一種蛋白質取代，以擴展載體的取向性。除此之外病毒基因組還編碼調節蛋白Tat和Rev，它們分別激活病毒轉錄并控制病毒轉錄物的剪接和核輸出[3]。另外4個基因編碼輔助蛋白Vif、Vpr、Vpu和Nef，這些產物是HIV在體內感染所必需的[4]。

2 慢病毒載體發展歷程

慢病毒載體系統最初是通過提取人類免疫缺陷病毒(HIV)基因組，并在其中添加反式的HIV多蛋白來構建的[5]，最早用于篩選HIV的治療藥物及靶向位點，后來在保證科研安全的前提下，被用于基因改造研究。該系統構建的基本原則是刪除病毒的毒力基因，將負責病毒顆粒包裝的反式作用元件、病毒包裝信號等分離，并使其具有攜帶外源基因的能力。

慢病毒發展到今日共經歷了4代轉變。第1代慢病毒以HIV為基礎，保留了基本基因結構，為避免病毒粒子進行自我包裝，將3′LTR、U3區的增強子和啟動子序列刪除，使病毒本身的LTR啟動子轉錄失活，但是不足之處是這種慢病毒滴度較低，且由于其識別位點受限主要侵襲CD4+細胞。第2代慢病毒載體將其包膜蛋白經過改造，由水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白代替，能夠識別一種廣泛膜受體-低密度脂蛋白受體(LOL)，促進病毒內吞，使慢病毒能夠輕松進入多種細胞中，同時病毒滴度可增至1 000 倍，擴大了慢病毒的適用范圍。第3代慢病毒載體在第2代的基礎上刪除了輔助基因vif、vpr、vpu和nef，進一步提高了安全系數。第4代慢病毒載體是目前應用最廣、最成熟的慢病毒系統，組裝構建過程分為四質粒部分，其中慢病毒轉移載體質粒部分攜帶需要轉入的基因片段，另外3個質粒(pMDL、pRev和pVSVG)則負責提供包裝所需的反式作用因子。質粒pMDL編碼Gag-Pol前體蛋白，最終被加工成整合酶、逆轉錄酶和結構蛋白；pRev與轉移載體中的順式作用元件(RRE)相互作用，增強未經酶切的全長基因組轉錄本的輸出；在病毒包膜中存在VSVG使病毒顆粒具有轉化多種細胞類型的能力[6]。通過將這4個質粒混合后轉入同一細胞表達株內進行包裝，最終獲得表達完整的慢病毒載體。同時該載體系統中進一步剔除了活性 LTR、Tat 或輔助蛋白，長末端重復序列的增強子或啟動子也被刪除，轉而添加土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(WPRE)，在顯著增加生物安全性的同時提高了轉導效率[7]。

3 慢病毒載體系統的應用

將外源基因轉入細胞中涵蓋多種方法，包括熱激、磷酸鈣、脂質體轉染、顯微注射、電穿孔、基因槍等，但這些方法都具有一定的局限性。慢病毒載體轉染效率高，可攜帶的基因片段大(>9 kDa)，能夠感染分裂期與非分裂期的多種細胞，且能實現長期穩定表達[8]。隨著目前表達載體的多樣化及可改造性，在研究中得到了廣泛的應用，為科研提供了便利。

3.1 構建穩定表達細胞系慢病毒載體能侵染各類細胞，且可攜帶熒光標記等信號，是構建細胞系的常用有效載體。利用慢病毒作為載體，篩選出的細胞系除了為科研提供基礎試驗材料，也具有重要的臨床應用價值。例如，可以分析基因的潛在功能，科研人員利用慢病毒載體將脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)導入小尾寒羊成纖維細胞系，發現該基因能夠顯著提高肉質，可以作為轉基因肉羊候選基因[9]；可篩選穩定轉染細胞并導入體內進行標記示蹤，追蹤細胞及胚胎發育分化過程，目前在人、豬、兔、馬屬動物等多種細胞中均有開展應用[10-12]；使用人抗病毒基因MxA重組慢病毒感染的雞精原干細胞，移植至受體后能夠繼續分化為精子，最后利用體外授精技術可以進一步獲得抗病毒轉基因雞[13]。

3.2 疾病治療

3.2.1RNA干擾技術 RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術是一種小分子雙鏈RNA介導的分子沉默機制，可以高效下調目的基因表達，是抗病毒治療的新手段。慢病毒載體作為RNAi研究的有效輔助手段，可以感染各種分裂時期細胞并實現穩定表達。在了解病毒毒力蛋白的基礎上，以慢病毒為載體構建靶向某個病毒致病基因位點的shRNA 進行細胞試驗或動物回歸試驗，通過檢測mRNA復制水平及病毒滴度測定等方法可以確定基因沉默效果及對病毒復制能力的抑制情況。楊少華等[14]在雞胚成纖維細胞和SPF雞胚中進行干擾試驗，確定了抑制 NDV增殖的shRNA 靶點RNAi-341和RNAi-671；齊興才等[15]以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作為靶基因，初步篩選了2個最佳抑制位點能夠降低口蹄疫病毒的復制效率。

3.2.2靶基因及通路篩選 病毒侵襲宿主需要特定受體位點識別，并與靶基因相互作用激活信號傳遞、物質代謝、周期調控等復雜信號通路，利于病毒在宿主體內復制生存，因此找到靶基因可為病毒疾病治療提供了一條新思路。慢病毒載體體系表達率高，可攜帶基因片段較長，極少誘發宿主產生免疫反應，是篩選靶基因的理想表達載體。例如在腫瘤疾病研究中，信號靶點是研究熱點，利用慢病毒體系進行信號靶點的篩選省時省力。張名媛等[16]構建以廣西巴馬小型豬為模型動物的miR-148b慢病毒表達載體，利用軟件輔助對其作用靶基因及相關通路進行了預測分析，為后續的功能研究及miRNA腫瘤治療藥物開發等提供理論指導。

3.2.3基因治療 基因治療是指將外源基因導入細胞中，糾正或彌補由于基因缺陷所造成的疾病。導入的外源基因主要分為正常基因、治療基因和“自殺基因”[17]。轉入正常基因或是能夠發揮正常功能的該基因片段，可以彌補先天性的基因缺失從而發揮治療作用，主要用于各類遺傳病的治療；而治療基因主要是指轉入對疾病具有明顯治療效果的靶基因，例如在小鼠慢性糖尿病疾病模型中，利用慢病毒載體在人臍帶間充質干細胞內轉入攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因，可以減少慢性創面愈合時間，加快組織修復[18]；“自殺基因”主要指胞嘧啶脫氨酶基因(CD)和編碼胸苷激酶的基因(TK)，可催化無毒的藥物前體轉變為細胞毒物質，殺死受體細胞。家婷等[19]構建HSV-TK/CD20雙自殺基因系統慢病毒載體，靶向誘導人外周血T細胞實現自我清除，為消除過度免疫治療產生的不良反應提供可控性。

3.3 疫苗研發當疾病發生時，疫苗免疫防控是避免其大規模流行的有效方式，在人及動物傳染病預防治療中均發揮重要作用。早期，研究人員發現逆轉錄病毒和慢病毒具有基因組整合能力，都是有效的病毒載體，相比之下，慢病毒載體能感染非分裂細胞，也無需直接靶向致病性抗原，可用于抑制自身免疫性疾病，是更加理想的載體[20]。成功接種疫苗的一個標志是誘導強而持久的記憶性T細胞反應，慢病毒載體具有持續高水平的抗原表達能力，產生大量功能分化的效應記憶T細胞，更利于控制類似HIV等早期感染病毒[21]。與廣泛使用的腺病毒載體相比，剔除整合特性的缺陷型整合慢病毒載體主要的靶細胞是不分裂樹突狀細胞(DC)的，規避了插入突變的安全性問題，為治療性疫苗接種提供了巨大的潛力，提示在大規模預防性疫苗接種中使用的可能性[22]。國外針對猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)及人艾滋病(AIDS)等已都進行了成熟的慢病毒疫苗研發及機制研究[23-25]。馬傳染性貧血病毒(EIAV)減毒疫苗是國內首次成功應用的慢病毒疫苗，通過對減毒活疫苗株多個基因的多重突變減弱其致病力，使用該疫苗進行的大規模免疫接種對中國馬傳染性貧血疾病的預防和控制做出了巨大貢獻[26]。

3.4 生產轉基因動物轉基因動物是分子生物學的拓展研究領域，也是生命科學研究領域重要的輔助科研手段。1978年美國科學家利用胚胎注射技術將生長激素導入小鼠受精卵獲得了世界首例轉基因動物，之后體細胞移植法生產的克隆羊“多利”使轉基因動物走進了大眾視野。轉基因動物生產技術發展至今已有顯微注射技術、逆轉錄病毒感染法、體細胞核移植法等多種成熟的技術方法[27]，其中以慢病毒作為載體，利用顯微注射技術將外源基因導入動物胚胎中可以顯著提高目的基因穩定表達率，甚至可以實現穩定的遺傳性狀，降低轉基因動物生產成本，吸引科研學者在豬、牛、羊等多種動物體中開展以該方法為基礎的轉基因動物試驗。鼠是人類疾病研究的首選模型動物，借助慢病毒載體生產特定組織轉基因鼠也是最常見的技術手段。對于鼠、豬、牛等哺乳動物，通過向未發育的受精卵卵周隙注射慢病毒載體顆粒再植入代孕母體子宮的方法，最終能夠獲取需要的轉基因動物[28]。而禽類技術相對較復雜，需要在卵殼膜氣室上面開1 m3小窗，將病毒液直接注射到卵黃上、下膜層之間，將卵殼膜使用透氣膠帶封口，放入孵化箱至破殼孵出[29]。一般注射使用的慢病毒表達載體會攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等標記物便于后期進行陽性動物篩選。

3.5 生物反應器在漫長的生物研究中，人們發現可以利用生物載體自身的代謝和繁殖系統來大量生產需要的蛋白產物，所利用的生物載體被稱為“生物反應器”。最初人們利用細菌和細胞作為反應器，但細菌生產的蛋白不具有生物活性，而細胞培養成本較高，使應用受限。隨著轉基因動物的研究，人們發現動物飼養成本低，并且能產生大量具有活性的目的蛋白，是理想的生物反應器。因此，衍生出乳腺、血液、雞輸卵管等相關生物反應器[30-32]。慢病毒載體以其穩定性、高效率、基因整合的天然優勢成為構建生物反應器的首選工具，產生的轉基因動物還能夠形成穩定的后代遺傳性狀，具有廣闊的應用前景。

4 展望

慢病毒載體系統的出現，推動了疾病研究進展，也加速了優良畜禽的篩選進程，推動了生物技術的發展。但目前慢病毒載體在轉染過程中仍存在病毒滴度過低，潛在的生物毒性等缺點，限制了臨床應用。如何進行優化，使慢病毒載體更加穩定，更好地與現有試驗技術相結合為動物研究服務將是日后關注的重點。