醋酸潑尼松對漿細胞性乳腺炎患者血清中Treg/Th17比值及炎癥因子的影響

李毅力，高 寒，李達學,李巧立

1.重慶市婦幼保健院乳腺科，重慶 400013;2.重慶市忠縣婦幼保健院檢驗科，重慶 404300

隨著社會生活節奏的加快，漿細胞性乳腺炎(PCM)的發病率正在逐年升高，占我國的乳腺疾病的1.9%～5.0%。PCM為臨床上以女性為常見的乳腺實質非特異性炎癥性疾病，好發于女性各個年齡階段，以年輕和非哺乳期的婦女較為常見[1-5]。臨床上其主要的病理學變化為乳腺導管周圍炎癥、乳腺導管擴張和壁纖維化，炎癥組織又浸潤大量漿細胞和淋巴細胞，因此本病又被稱為導管周圍性乳腺炎和乳管擴張癥[6-7]。PCM的發病機制較為復雜，近年研究認為免疫分子和免疫細胞為重要的發病機制[8-9]。有研究表明，因患者體內的炎癥因子發生變化，PCM患者體內的調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)數目及比例發生異常[1,10]。此外，有研究證明，醋酸潑尼松具有明顯的治療PCM的作用[7,11]。因此，本研究探討醋酸潑尼松對PCM患者的Treg細胞、Th17細胞比例以及二者的比值與炎癥因子的表達情況，以期針對PCM建立針對性的治療策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月至2019年10月重慶市婦幼保健院乳腺科收治的PCM患者80例，將其隨機分為觀察組和對照組，每組40例。納入標準：(1)空芯針穿刺經過細胞學檢查，同時經過超聲檢查確診為PCM；(2)非哺乳期婦女；(3)未進行激素治療；(4)無炎癥性疾病；(5)臨床資料較為完整，同意并服從安排。排除標準：近期利用激素治療的患者；(2)伴有其他感染性疾病患者；(3)合并出血傾向、免疫系統疾病、惡性腫瘤、心肺肝腎功能疾病、血液系統疾病和嚴重的精神系統疾病患者；(4)依從性差不能配合完成研究的患者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。按照中華預防醫學會婦女保健分會乳腺保健與疾病防治學組對PCM的分期，將其分為溢液期、腫塊期、膿腫期和瘺管期。兩組患者年齡、病程和PCM分期情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法 對照組患者給予哌拉西林舒巴坦(國藥準字H20060431)治療，每次4.50 g，每天3次，連續靜脈滴注7 d；觀察組在對照組的基礎上給予口服醋酸潑尼松片(國藥準字H44024469)治療，每次30 mg，每天1次；治療7 d后，每次25 mg；治療14 d后，每次20 mg，依次減停藥。在兩組患者入院時(治療前)及治療結束后(治療后)分別抽取清晨空腹靜脈血2管(每管約3 mL)。(1)一管采用抗凝管，靜置30 min，取血清和下層紅細胞之間的分層處血液約500 μL，用來分析免疫細胞。Treg細胞的前處理過程：將所取得的細胞加入紅細胞裂解液，重懸(緩慢搖動)，室溫靜置5 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)；然后4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS重懸(緩慢搖動)；靜置3 min，取上部12 mL，移入新管；4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS重懸，細胞濃度為(4～10)×109個/L；取樣100 μL，加CD3 2 μL，加CD4 4 μL，加CD25，4 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置15 min；加PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加破膜劑foxp3 900 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置60 min；加PBS 1 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加抗體foxp3-PE 5 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置60 min；加PBS 1 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清，4 ℃避光保存，待測。Th細胞的前處理過程：將所取得的細胞加入紅細胞裂解液，重懸，室溫靜置5 min，加入PBS；加入刺激劑2 μL，刺激4～6 h；加PBS，4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 μL血清封閉，37 ℃孵育30 min；取出后加抗體(CD3、CD4、CD25)2.5 μL，用槍頭將細胞和抗體吹勻，4 ℃ 孵育30 min，加2 mL PBS重懸，400×g離心5 min，棄上清；加Fix/Perm 1 mL重懸，4 ℃ 孵育40～50 min后加1 mL wash buffer洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后加2 mL wash buffer重懸，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加80～100 μL wash buffer及抗體[干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-4、foxp3和IL-17]2.5 μL，4 ℃ 靜置40～50 min，加2 mL wash buffer，400×g離心5 min，棄上清，再加2 mL wash buffer，400×g離心5 min，棄上清，4 ℃避光保存，待測。利用BD公司的流式細胞分析儀，分析血液中的Treg細胞及Th細胞。(2)另一管則采用促凝管，靜置30 min，采用卓越 400 全自動生化分析儀(上海科華實驗系統有限公司)測定炎癥因子IL-6、C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

2 結 果

2.1兩組患者Treg細胞、Th17細胞比例及Th17/Treg比值比較 兩組患者治療前Treg細胞、Th17細胞比例及Th17/Treg比值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。經過治療后，兩組患者Treg細胞、Th17細胞比例均較治療前得到改善，且觀察組的Treg細胞比例顯著低于對照組，Th17細胞比例、Th17/Treg比值顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2兩組患者治療前后炎癥指標比較 治療前，檢測兩組患者的炎癥因子(CRP、IL-6和TNF-α)水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，然而治療后，兩組患者的炎癥因子水平均較治療前降低，觀察組炎癥因子水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者調節性T細胞、Th17細胞比例及Th17/Treg比值比較

表3 兩組患者治療前后炎癥指標比較

3 討 論

PCM臨床癥狀以乳頭溢液、凹陷，乳房疼痛腫脹和有腫塊為主，嚴重影響女性的身體健康和生活質量，其病因不明，多認為與乳頭內陷、上皮細胞角質化、乳房外傷、厭氧菌感染、吸煙、內分泌紊亂、免疫功能紊亂等有關，其中免疫紊亂和炎癥為當下發現的PCM的重要發病機制[8,12-13]。醋酸潑尼松為臨床上常用的具有較強抗炎作用的糖皮質激素[14]。因此，本研究利用醋酸潑尼松治療的方式對PCM進行治療，并觀察其對患者免疫細胞和炎癥因子表達情況的影響，并且通過研究發現，醋酸潑尼松可明顯改善免疫細胞的功能，PCM發生時患者Treg細胞比例降低，然而Th17細胞比例升高。

Treg細胞和Th細胞均為CD4+T淋巴細胞亞群，在正常條件下二者保持動態平衡，以維持機體的免疫應答的穩態[15-16]。PCM發生時，乳腺導管因阻塞而導致擴張，阻塞導管的病理物質可刺激管壁發生炎癥浸潤，進而發生纖維組織的增生，乳腺導管上皮發生脫落，刺激乳腺腺體發生免疫反應，使得漿細胞浸潤，因此PCM為自身免疫性疾病[7-8]。有研究表明，Th17細胞增多，說明機體處于炎癥狀態，而Treg細胞減少，提示其抑制炎癥的作用降低[17]。Th17細胞、Treg細胞比例失調也提示PCM患者處于炎癥狀態[1]。本研究中，通過治療后Treg細胞比例升高，Th17細胞比例降低，因此Th17/Treg比值降低。

研究顯示，醋酸潑尼松可以明顯改善人體的免疫功能，其作為臨床上常用的一類人工合成的皮質類固醇激素，可以通過抑制細胞免疫反應和炎性反應而減輕毛細血管得擴張、滲出和水腫，可以起到調節免疫細胞的作用[18-20]。PCM發生的一個重要得病理機制為感染厭氧菌，使乳腺從無菌性炎癥轉化為化膿性炎癥。醋酸潑尼松可與糖皮質激素受體結合，通過作用于IL-6、IL-8和環氧化酶等多種炎癥因子發揮抗炎作用[21-22]。本研究結果發現，醋酸潑尼松可明顯抑制機體炎性反應，調節免疫細胞功能，治療療效肯定，值得推廣應用。