ROS對糖尿病大鼠血脂代謝及腎臟組織中VEGF的影響*

陳海蘭，盧黎明，郭海霞，高 宇，薛 晶

1.中國人民解放軍第九八一醫院腎臟內分泌科，河北承德 067000；2.中國人民解放軍第九八一醫院衛勤處，河北承德 067000;3.承德醫學院附屬醫院內分泌科，河北承德 067000；4.河北省承德醫學院形態實驗中心，河北承德 067000

糖尿病屬于內分泌系統高發疾病，具有慢性進展性，糖尿病的產生由多環境、多因素共同導致。我國糖尿病患者發病率逐年升高，嚴重危害患者生命健康。糖尿病患者機體代謝系統受到損傷，從而進一步導致多種疾病產生，其中腎臟首先受到損傷，主要表現在腎臟功能衰退，對降糖物質的排泄減少，且導致藥物在機體停留時間增加，腎臟負擔加重。目前，藥物是治療糖尿病疾病的主要方式，但是治愈難度大，因此了解其發病機制及尋找有效藥物對于改善糖尿病患者生存及預后具有重要幫助[1]。近年來，中藥因其藥源廣泛性在治療糖尿病中逐漸受到重視。地黃是玄參科植物，生物活性廣泛，具有清熱、涼血、補血等功能。地黃寡糖(ROS)為地黃主要成分，現代藥物學發現ROS具有增加機體免疫，改善內分泌功能及抗自由氧等作用。糖尿病的產生及發展與血管增生具有重要關聯。血管內皮生長因子(VEGF)生物活性廣泛，在多種病理組織中發揮不同作用[2]。但是目前關于ROS對糖尿病中VEGF的影響研究較少，因此，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察ROS對血脂代謝及腎臟組織中VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只SPF級SD大鼠，雌雄各半，購自常州卡文斯動物實驗，平均體質量0.10～0.15 kg，在常溫下進行無菌飲食2周，按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2藥品與試劑 二甲雙胍(批號：020413)購自正安醫藥集團有限公司；兔抗人VEGF抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自上海佰世凱生物化學科技有限公司；甲醛、乙醇購自泰州華宇醫療器械有限公司。

1.3方法

1.3.1分組及糖尿病大鼠建模 40只SPF級大鼠按照隨機數字表法分為健康組、DM組、ROS組及藥物對照組，每組10只，雌雄各半。DM組、ROS組及藥物對照組大鼠均建立糖尿病模型。 糖尿病模型通過高脂飼料聯合STZ建立。高脂飼料配方：基礎飼料、豬油、蔗糖、蛋白占比分別為68%、10%、20%、2%。飼養60 d后空腹15 h后注射STZ(30 mg/kg)，連續7 d檢測血糖值，血糖≥16.7 mmol/L則建模成功，進行下一步實驗。

1.3.2干預方法 建模7 d后，ROS組采用ROS灌胃，藥物對照組采用二甲雙胍灌胃，健康組及DM組采用生理鹽水灌胃，劑量均為200 mg/(kg·d)，干預時間均為22 d。

1.3.3血脂代謝指標檢測 采集大鼠空腹靜脈血2 mL于EP管中，4 000 r/min離心后保留血清，采用生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)水平。

1.3.4腎臟重量檢測 血脂代謝指標檢測結束后，采用頸部脫臼方法處死大鼠，分離腎臟，采用電子天秤稱重，計算方法：腎臟指數=[器官重量(g)/動物體質量(g)]×1 000。

1.3.5HE染色進行腎臟組織形態學觀察 實驗結束后，將腎臟采用甲醛固定，石蠟包埋，進行4 μm切片，乙醇脫水，封片，染色，置于200倍顯微鏡下觀察腎小球間質等病理結構，其余腎臟組織置于低溫冰箱保存備用。

1.3.6免疫組織化學(免疫組化)檢測腎臟組織VEGF陽性表達情況 腎臟組織采用10%的甲醛固定，切片，脫蠟，脫水，置于37.5 ℃ 0.5 h后加入1%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，血清封閉0.5 h，加入一抗，4 ℃過夜，加入兔抗人VEGF抗體，加入二抗0.5 h后，復染，封閉。陽性細胞為淡黃色至棕褐色，顯微鏡觀察選取200倍下20個視野，計算細胞陽性率。

1.3.7Western blot檢測VEGF蛋白相對表達量 腎臟組織加入胰蛋白裂解液，離心后取上清液加入樣孔，進行電泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min，反復用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，每次5 min，分別加入兔抗人VEGF，GAPDH抗體(1∶500)、過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)，分別雜交，PBS沖洗。后將PVDF膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

2 結 果

2.1ROS對各組大鼠血脂代謝指標的影響 與健康組比較，DM組、ROS組、藥物對照組血脂指標TC、TG升高，HDL-C降低，差異有統計學意義(P<0.05)；經藥物干預后，ROS組、藥物對照組TC、TG明顯低于DM組，HDL-C明顯高于DM組，差異有統計學意義(P<0.05)；且ROS組TG明顯低于藥物對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ROS對各組大鼠血脂代謝指標的影響

2.2ROS對各組大鼠腎臟重量及指數的影響 與健康組比較，DM組、ROS組、藥物對照組大鼠腎臟重量及腎臟指數均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；藥物干預后，與DM組比較，ROS組及藥物對照組腎臟重量及腎臟指數明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；ROS組與藥物對照組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ROS對各組大鼠腎臟重量及指數的影響

2.3ROS對各組大鼠腎臟組織的影響 健康組大鼠腎臟結構完整，腎小球基質分布清晰，未見增生及肥大；DM組大鼠腎小球基質模糊，毛細血管增厚，炎性反應浸潤嚴重，腎小球出現肥大；經藥物干預的ROS組及藥物對照組上述病理情況均好轉，癥狀減輕。見圖1。

2.4免疫組化檢測腎臟組織中VEGF陽性表達 健康組、DM組、ROS組及藥物對照組大鼠腎臟組織中VEGF陽性表達率分別為(15.49±2.09)%、(34.30±5.40)%、(20.39±3.02)%、(21.04±3.15)%，組間比較，差異有統計學意義(F=49.530，P<0.05)。DM組VEGF陽性表達率明顯高于健康組，差異有統計學意義(t=10.290，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF陽性表達率明顯低于DM組，差異有統計學意義(t=7.125、6.723，P<0.001)，但ROS組及藥物對照組比較，差異無統計學意義(t=0.471，P=0.643)。見圖2。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態學觀察結果

2.5Western blot檢測腎臟組織VEGF蛋白表達情況 健康組、DM組、ROS組及藥物對照組大鼠腎臟組織中VEGF蛋白相對表達量分別為1.00±0.15、3.03±0.33、1.45±0.27、1.50±0.30，組間比較，差異有統計學意義(F=109.100，P<0.001)。DM組VEGF蛋白相對表達量明顯高于健康組，差異有統計學意義(t=17.880，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF蛋白相對表達量明顯低于DM組，差異有統計學意義(t=11.870、10.990，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(t=0.392，P=0.699)。見圖3。

圖2 各組大鼠腎臟組織VEGF陽性表達情況

圖3 各組大鼠腎臟組織VEGF蛋白表達情況

3 討 論

糖尿病是全球高發內分泌系統疾病，且30%的患者會累及其他器官，并發癥發生率最高的機體器官是腎臟。隨著糖尿病疾病的發生、發展，機體腎臟代謝平衡遭到破壞，持續高血糖、血脂會提高血液黏稠度，增加微血管疾病的發生，最終導致糖尿病腎病。中藥在臨床疾病的治療中具有重要作用，地黃作為治療糖尿病傳統藥物之一，歷史悠久，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，灌胃ROS，觀察其對糖尿病的療效。

傳統醫學將糖尿病歸屬到消渴范疇，首見于《內經》體系，理論逐漸完善于唐宋，歷代醫家對消渴論述較為豐富。隋朝《諸病源候論》提及“腎虛腎燥則渴，不能傳致水液，故隨飲小便”，表示糖尿病與腎臟密切相關。地黃為治療糖尿病疾病的傳統藥物，具有內熱消渴，涼血清熱等功效[3]。ROS是中藥傳統地黃的主要成分，能夠有效治療糖尿病疾病，改善血脂代謝紊亂，主要通過降低肝糖異常分泌，進而降低TC、TG。糖尿病患者臨床表現為血脂代謝及水失衡，血漿中TC、TG明顯升高，HDL-C降低，表明機體葡萄糖穩態遭到破壞。而ROS能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂，是通過改善胰島素抵抗而改善血脂、血糖代謝。二甲雙胍為常見糖尿病用藥，但是與ROS比較，ROS能夠有效改善血脂代謝失衡，降血糖作用較溫和，二甲雙胍降血脂同時能誘發TG升高，導致不良反應發生。本研究結果顯示，與DM組比較，ROS組及藥物對照組大鼠血脂代謝指標均出現改善，ROS與二甲雙胍比較，對血脂改善效果更佳。

糖尿病患者腎臟是最早受到損傷的器官，持續高糖可能改變腎臟微環境，增加腎臟排泄負擔，加重腎臟損傷，導致腎臟增生、肥大，而腎臟重量是直接反映腎臟肥大的主要指標，準確度較高[4]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠建模成功后，腎臟重量增加，這與腎臟功能損傷關系密切。從現代藥物學角度來講，ROS能夠通過改善血管內皮通透性，從而減少糖尿病大鼠腎臟中有害物質，多環節、多信號共同作用降低大鼠腎臟重量，改善毛細血管增厚情況，降低腎小球濾過率，避免出現腎臟肥大[5]。本研究結果顯示，ROS組及藥物對照組腎臟重量均明顯低于DM組，說明ROS能夠通過降低糖尿病大鼠腎臟重量而改善病情。

VRGF分泌合成主要靠腎臟完成，是一種特異度較高的血管內皮生長因子。在健康人機體中其表達減少，在糖尿病患者機體內表達升高，其主要原因是糖尿病患者機體內外氧氣交換不足導致機體處于缺氧狀態，激活VEGF表達。以往研究顯示，VEGF能夠加快血管新生，提高內皮細胞生物活性，加快糖尿病腎臟發生、發展[6]。此外，VEGF升高時能夠在細胞膜中形成特定通道，提高血管內外通透性，加快多種大分子物質穿過，增加腎臟負擔，加重糖尿病腎病病情。VEGF能夠通過分泌大量細胞因子增加腎小球基質厚度，進一步增強炎性反應，惡化病情。而以地黃為主要成分的ROS藥物能抑制糖尿病大鼠血管重建，改善血瘀[2]。糖尿病腎病大鼠存在血運不暢，傷及脈絡，可加快機體微環境紊亂。ROS具有抑制VEGF表達，在缺氧疾病中能夠明顯降低VEGF。康偉等[7]研究表示，地黃具有降低惡性腎炎中VEGF水平，改善血管炎性反應。本研究結果顯示，ROS與二甲雙胍均能夠降低糖尿病大鼠腎臟組織中VEGF，與DM組差異較大，說明ROS能夠通過抑制VEGF表達而改善糖尿病病情，加快好轉。

綜上所述，灌胃ROS能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝指標，降低腎臟重量，這可能與抑制VEGF表達具有一定的關系。