H型高血壓患者MTHFR C677T基因多態性及其與血壓、HCY水平的關系*

韋寶敏，潘興壽，李天資，梁 燁，李近都

1.右江民族醫學院附屬醫院心血管內科，廣西百色 533000；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科，廣西南寧 530012

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸在分解代謝中產生的活性甲基供體循環代謝重要的限速酶[1]，其主要作用是在葉酸代謝通路中將沒有生物學功能的5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。后者進入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸(HCY)的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基，并且使血液中的HCY水平保持在較低水平[2-5]。研究表明，MTHFR基因C677T位點堿基變異可以造成MTHFR的活性變化，從而影響HCY在循環體內的代謝，造成血漿HCY升高，在高血壓患者中伴有HCY升高者稱為H型高血壓，此類患者出現明顯的血管內皮細胞損傷，血管平滑肌細胞增殖，低密度脂蛋白的氧化功能低下，血小板激活，血栓形成等臨床特征，危害患者的生命健康[6]。本課題組以本院接受診療H型高血壓患者135例與非H型高血壓者134例為研究對象，了解H型高血壓患者MTHFR基因C677T位點堿基的分布特征及其與血壓、HCY水平的關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1．1一般資料 (1)選取2019年1-8月在本院接受診療的H型高血壓(觀察組，HCY>10 μmol/L)患者135例和非H型高血壓(對照組，HCY≤10 μmol/L)患者134例為研究對象。觀察組男83例，女52例，年齡24～84歲，平均(46.1±13.0)歲；對照組男70例，女64例，年齡23～77歲，平均(46.3±12.3)歲。兩組年齡及性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究按照倫理規范設計研究方案，經醫院倫理委員會批準，所有受檢者對本研究知情同意。

1.2儀器與試劑 PTC-200 PCR儀(美國Bio-Rad公司)，3730XL測序分析儀和POP-7TM高分子聚合物(Applied BiosystemsTM公司)，Gel Doc XR+BIO-RAD全自動凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，超微量分光光度計Nano Vue(GE Healthcare公司)，DYCP-34A瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。ABI 3100全自動序列分析儀(美國ABI公司)。主要試劑：QIAamp DNA Blood Maxi血液基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，Premix Ex TaqTMVersion 2.0(Loading dye mix公司)，Tris-硼酸鹽-乙二胺四乙酸(Tris-borate-EDTA，日本TAKARA公司)，HCY檢測試劑盒(德國BAYER公司)。

1．3方法

1.3.1調查方法 調查受檢者年齡、性別、病史、身高、體質量、血壓。受檢者先測身高、體質量，后測量血壓。測量血壓用汞柱血壓計，受檢者測量前不吸煙、飲酒，不飲濃茶或咖啡，不做劇烈運動，保持安靜休息≥30 min。受檢者取坐位，平坐5 min后行血壓測量，每例受檢者連續測量3次，每次間隔≥120 s，取3次血壓計數的平均值作為受檢者血壓。平均收縮壓≥140 mm Hg或平均舒張壓≥90 mm Hg確診為高血壓[7]。

1.3.2標本的采集與處置

1.3.2.1用于PCR的標本采集 (1) 抗凝劑用檸檬酸抗凝液(右旋葡萄糖1.47 g，檸檬酸0.48 g，枸櫞酸鈉1.32 g，加H2O至100 mL)。采集受檢者外周靜脈血3 mL，置于存有0.5 mL 檸檬酸抗凝液的凍存管中，置于0 ℃冰箱保存40 h后轉-70 ℃冰箱貯存。(2)基因組DNA提取：用EDTA抗凝管采集受檢者外周靜脈血3 mL，置于20 ℃室溫2 h，嚴格按照QIAamp DNA Blood Maxi試劑盒說明書操作。

1.3.2.2用于HCY檢測的標本采集 受檢者禁食≥10 h，于早晨6:30-9:30，采取坐位，用EDTA抗凝管抽肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血漿置-40 ℃冰箱凍存備查。HCY采用化學發光法測定。

1.4基因擴增與鑒定 基因型鑒定采用PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法[8]。引物由杭州聯川生物技術有限公司合成。MTHFR基因C677T的單核苷酸多態性(SNP)上游引物序列為5′-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3′，下游引物序列5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。反應條件:94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環擴增，隨后72 ℃延伸5 min。4%瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切結果：純合野生型C/C(CC型)僅有一條198 bp條帶；純合突變型T/T(TT型)可被酶切為175 bp和23 bp 2個條帶；雜合子C/T(CT型)應包括198 bp、175 bp和23 bp 3個條帶。

2 結 果

2.1兩組患者血壓和HCY水平比較 觀察組收縮壓和HCY水平高于對照組(P<0.05)，舒張壓水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者血壓和HCY水平比較

2.2兩組患者MTHFR基因 C677T位點堿基頻率和等位基因分布 觀察組MTHFR基因C677T位點CC、CT、TT基因型頻率和等位基因頻率與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.3兩組患者MTHFR基因 C677T位點不同堿基與血壓、HCY水平的關系 觀察組CC、CT和TT型收縮壓水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。在觀察組中，TT型收縮壓水平高于CC型(P<0.05)，也高于CT型(P<0.05)。在對照組中，TT型收縮壓水平高于CC型(P<0.05)，TT型收縮壓水平與CT型比較，差異無統計學意義(P>0.05)。提示MTHFR基因 C677T位點TT純合子突變患者收縮壓水平比較高。觀察組CC、CT和TT型的舒張壓水平與對照組比較,差異無統計意義(P>0.05)。在觀察組和對照組中，CC、CT和TT型的舒張壓水平比較，差異無統計意義(P>0.05)。提示MTHFR基因C677T位點TT純合子突變對舒張壓水平沒有太大的影響。觀察組CC、CT和TT型HCY水平高于對照組(P<0.05)；在觀察組中，TT型HCY水平高于CC型(P<0.05)，也高于CT型(P<0.05)；在對照組中，TT型HCY水平高于CC型(P<0.05)，TT型HCY水平與CT型比較,差異無統計學意義(P>0.05)。提示MTHFR基因 C677T位點變異對HCY水平有明顯的影響，表現為TT型HCY水平高。見表3。

表2 兩組患者MTHFR基因C677T位點堿基頻率和等位基因頻率[ n(%)]

表3 兩組患者MTHFR C677T 不同基因型血壓、HCY水平比較

3 討 論

有研究表明，高血壓是由遺傳因素和環境因素共同作用而導致，其中環境因素的比例約占70%，遺傳因素的比例約占30%，通過對高血壓患者的易感性基因檢測，明確患者基因的特征，針對患者基因情況制訂防治方案，是新興的解碼健康的個性醫療實踐[7]。研究認為，MTHFR基因第4外顯子第677個核苷酸位點堿基變異是最常見的突變位點，C677T是編碼蛋白質的密碼子，位于MTHFR的活性區域，TT純合子突變其堿基C被T置換，使MTHFR基因編碼蛋白質的第222 個氨基酸丙氨酸被纈氨酸替代，影響MTHFR的活性和耐熱性。有報道稱CT雜合子突變型患者MTHFR酶活性僅為CC野生型的65%，TT純合子型突變患者其酶活性僅為CC野生型的30%，其對患者全身代謝的影響可以想象[8]。有學者從遺傳性同型半胱氨酸尿癥死亡兒童尸檢中發現，其體循環內存在廣泛的動脈血栓形成及動脈粥樣硬化的病理表現，由此提出高同型半胱氨酸血癥(HHCY)可導致動脈粥樣硬化性血管性疾病的假說，掀起了HHCY與血管疾病相關研究的浪潮[9]。HCY是一種含巰基的氨基酸，其前身主要來源于飲食攝取的甲硫氨酸，是甲硫氨酸和半胱氨酸代謝過程中的中間代謝產物，其本身并不參加蛋白質的合成。在體內，約一半的HCY和甲基四氫葉酸在甲硫氨酸合成酶的作用下生成甲硫氨酸和四氫葉酸，四氫葉酸在MTHFR的作用下生成甲基四氫葉酸；其余約一半的HCY通過轉硫基途徑與絲氨酸在胱硫醚β合成酶作用下形成胱硫醚，在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水[10]。TT純合子型突變產生的代謝障礙，可導致血漿HCY升高。HHCY導致血管內皮細胞損傷，促進血管平滑肌細胞增殖，影響低密度脂蛋白的氧化，增強血小板功能，促進血栓形成，但其相互作用的機制還不完全清楚[11]。本研究結果顯示，MTHFR基因C677T位點突變對收縮壓和HCY水平有影響，H型高血壓組MTHFR 基因C677T位點TT基因型頻率高于非H型高血壓組(P<0.01)，MTHFR基因C677T TT純合子突變患者其收縮壓水平較其他基因類型高(P<0.05)，其舒張壓水平與其他基因類型比較，差異無統計學意義(P>0.05)，MTHFR 基因C677T位點TT純合子突變的HCY水平較CC野生基因型高，較CT雜合子型高(P<0.01或P<0.05)。

本研究提示，MTHFR基因C677T位點TT純合子突變是血漿HCY水平增高的原因之一，而血漿HCY水平增高是動脈粥樣硬化發病的獨立的危險因素之一。雖然HCY確切的致病機制尚未完全明了，但臨床資料顯示，H型高血壓患者動脈損害的速度加快，強度加大，發生心肌梗死、腦卒中等血管事件的概率較高，對患者生命健康的危害倍增[12-13]。因此，在高血壓等慢性血管疾病的防治過程中，應當從國家制訂的全民健身實施計劃綱要出發，重視了解患者的基因情況。對于MTHFR基因C677T位點TT純合子突變的攜帶者，調整防治方案，選取高度敏感性的藥物，同時強化健康生活方式，養成有益于健康的習慣化的行為方式，調節膳食和適量運動[14]。