新型冠狀病毒核酸臨床檢測要點及經驗

范萃

摘要：2019冠狀病毒病（2019-nCoV/SARS-CoV-2）疫情已成為國際關注的突發公共衛生事件。為應對突發病毒疫情事件，加快病毒檢測并提高檢測準確性變得非常重要。中華人民共和國國家衛生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎診療方案》規定了核酸檢測和基因測序作為確診病例的方法，檢測結果是對潛伏期人群、疑似病例人群和隔離期人群的新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2）進行確診的重要依據。本文對核酸檢測結果判定及要點進行了分析，總結了經驗并對未來發展進行了展望。

關鍵詞：新型冠狀病毒;核酸檢測;經驗總結

引言：

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下簡稱新冠病毒）是一種新型β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染，基因組序列約由29 kb構成，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白。2019年12月突如其來的一場病毒疫情，引發對全球健康的關注，再次讓我們體會重視生命，挽救生命的意義。在核酸檢測過程中的各個環節中存在較多因素，本文將目前我院新冠病毒核酸檢測中的部分環節及其中可能影響核酸檢測結果的部分因素進行描述。

一、新冠病毒核酸檢測方法

在疫情初期，我國最早采用的是高通量PCR檢測技術。隨著疫情的發展，這種檢測技術無法在國內大量推廣。隨之而來，很多的廠家推出了基于實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術的試劑盒，這種檢測技術在國家衛建委的推動下得到了很大的推廣和應用。目前我院新冠病毒核酸檢測針對的位點主要包含病毒基因組中2段保守基因序列，即以開放讀碼框1ab（ORF1ab）、 核 殼 蛋 白 （N）基因作為檢測靶標[4]。

二、新冠病毒核酸檢測樣本核酸提取方法及病毒核酸檢出情況

由于目前臨床常見鼻咽拭子樣本存在核酸檢出率較低的問題，對提取方法及提取流程進行有實驗數據依據的選擇及優化是有必要的。新冠病毒核酸檢測所采用的實時熒光定量PCR是臨床分子檢測中常用的檢測方法，在以往采用RT-PCR對病毒核酸進行的檢測中，磁珠法是較為常用的核酸提取方法。此外因各檢測試劑盒要求，一步裂解釋放法也在臨床大量應用。不同的病毒核酸提取方法因其提取產物濃度、純度的差別及對RNA的保護程度不同，一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽性樣本的核酸檢出。經過我們自己初始實驗，對我院7例已確診患者原始樣本（均為生理鹽水保存液的鼻咽拭子樣本）同時采用不同提取方法后的核酸檢測結果顯示，分別采用一步裂解釋放法及磁珠法提取后，PCR檢測的CT值無顯著差異（P>0.05）。

三、核酸檢測結果判定及要點分析

新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第五版），簡稱”指南”中，核酸檢測實時熒光RT.PCR方法，主要是對ORFlab和N兩個靶標進行測定。采用同一份標本進行檢測，當實時熒光RT-PCR檢測的這兩個靶標出現結果均為陽性時，確認為陽性病例;若單個靶標是陽性檢測結果，需要重新進行實驗，從采樣開始再次進行實時熒光RT-PCR檢測，檢測結果依舊是單個靶標陽性檢測結果，則確認為陽性。

第二種現象是，當以兩種標本進行實時熒光RT-PCR檢測同時出現單靶標陽性結果，確認為陽性病例;當同種類型標本經過2次采樣檢測，2次單個靶標均為陽性檢測結果，可判定為陽性病例。當出現核酸檢測結果陰性時，為防止判定錯誤，需要對檢測的影響因素進行認真排除，避免產生假陰性。產生假陰性的主要因素包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本采樣質量不好，有的沒有采到帶有病毒的上皮細胞，病毒含量低;樣本收集時間把控不好，過早或過晚;樣本采集后的保存不當，溫度過高、保存時間過長;運輸和處理樣本不正確操作;檢測中技術問題的原因，如沒有考慮到病毒變異、PCR抑制等。

當出現不可確定的可疑情況，應采用多種方法多種試劑重復實驗，或采用敏感度更高的方法，如數字PCR方法進一步確定。當根據指南Ct值判斷時，規定的是無Ct值或Ct>40結果判斷為陰性結果;Ct值<37，為陽性;當Ct值在37-40灰度區間時，建議重復做實驗，若重做結果ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，則判斷該標本為陽性，否則為陰性結果。需要強調的是，對病毒量低的標本進行病毒2019-nCoV/SARS-CoV-2核酸檢測，特別是潛伏期、疑似病例人員，更加需要仔細了解試劑盒的檢出限進行實驗;應結合標本可能的病毒量選擇具有不同檢出限的試劑盒，并在檢測時注意影響因素，并可使用數字PCR方法進一步確定，避免由于病毒量少而檢不出的現象，最終獲得準確的檢測結果。

四、經驗總結及展望

綜上所述，目前新冠病毒所致疾病其病理生理過程還未完全闡明，全國各臨床實驗室檢測方式未標準化，然而核酸檢測也有其局限性，加上其核酸檢測試劑盒研發時間緊迫，沒有足夠的評估及大樣本的臨床驗證，同時也存在不同品牌產品的核酸試劑盒RT-PCR分析方法檢測結果會有不同，檢測效果良莠不齊，故對于臨床上新冠病毒核酸檢測結果為陰性或單通道陽性的樣本均需要謹慎對待，考慮到各環節中可能造成結果不準確的影響因素。各臨床實驗室應在現有指南和相關研究報道的基礎上，根據自身實驗室情況對新冠病毒核酸檢測全過程實施嚴格的質量控制、制定合理的優化自己的標準操作流程。同時，目前實驗室已開始檢測新冠病毒IgM及IgG抗體，更靈敏的核酸檢測方法如數字PCR也開始應用于新冠病毒的核酸檢測，部分研究團隊著力于探索更加高效的新冠病毒實驗室診斷模型，有望在新冠病毒的實驗室檢測方面大大降低假陰性率;部分研究團隊著力探索如何更快更便捷的開展新型冠狀病毒核酸檢測技術，為更好更快地確診和篩查新冠病毒感染者提供事實依據。

參考文獻：

[1]國家衛生健康委.新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）[EB/OL].http：//www.cntcm.com.cn/2020-03/05/content_72030.htm，2020-03-05.

[2]高亭，徐仰玲，何小鵬，等.40例新型冠狀病毒肺炎的流行病學及臨床特征分析[J].中國呼吸與危重監護雜志，2020，19（02）：148-153.

[3]王旭東，施健，丁偉峰，等.2019新型冠狀病毒核酸檢測的研究狀況與應用探討[J].臨床檢驗雜志，2020，38（02）：81-84.

[4]鐘慧鈺，趙珍珍，宋興勃，等.新型冠狀病毒核酸臨床檢測要點及經驗[J].國際檢驗醫學雜志，2020，41（5）：523-526.

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