云南省宣威地區肺癌患者的炎癥小體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3基因多態性▲

呂國利 雷又鳴 李 楊 施云飛 段 晉 劉寅強 趙 煒 陳 楠

(昆明醫科大學第一附屬醫院1 老年胸外科，2 內分泌二科，云南省昆明市 650031，電子郵箱：lvguoli2009@163.com；3 云南省腫瘤醫院胸外二科，昆明市 650118)

肺癌是全球范圍內發病率和致死率均極高的一種惡性腫瘤，而中國云南省宣威市肺癌的發病率及死亡率在國內乃至全球均位居前列[1]，其中該地區男性和女性的肺癌死亡率分別為全國平均水平的4倍和8倍[2]，現已證實燃煤引起的室內空氣污染為該地區肺癌發生的主要誘因[3]。既往研究表明，在宣威同一地區甚至同家族中，個體患肺癌風險存在巨大差別，推測可能與某種基因多態性有關[4]。近十年來，炎癥小體與腫瘤之間的關系是國內外的研究熱點，其中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)與肺癌有關[5]。目前，國內暫無炎癥小體NLRP3基因多態性與宣威地區肺癌的相關研究。故本研究通過TaqMan探針法對NLRP3炎癥小體進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型，旨在探討炎癥小體NLRP3基因多態性與云南省宣威市居民肺癌遺傳易感性的相關性，以期為該地區肺癌的早期篩查、早期干預提供可靠的指導依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2017年6月到2019年10月昆明醫科大學第一附屬醫院收治的來自云南省宣威地區的80例肺癌患者(觀察組)為研究對象。納入標準：(1)均來自云南省宣威地區，并在該地區居住18年以上；(2)病理明確為肺癌；(3)采血前未接受任何放化療或抗腫瘤治療；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并如糖尿病、強直性脊柱炎及系統性紅斑狼瘡等與基因突變有關的疾病；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并嚴重血液系統疾病或傳染性疾病；(4)與已納入者有血緣關系。同時選取100例健康體檢者作為對照組，均來自云南省宣威地區并在該地區居住18年以上，且與已納入者無血緣關系。本研究遵循世界醫學協會赫爾辛基宣言。

1.2 資料收集 收集所有研究對象的性別、年齡、民族、職業、吸煙史、居住情況、生活習慣、燃煤使用或接觸史等基本資料。無煙煤接觸定義為5年內未用煙煤作為家庭燃料或生產燃料，職業接觸定義為從事下井挖煤工作或煤礦工作[6]。

1.3 檢測方法

1.3.1 酶聯免疫吸附法：使用抗凝管采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血約3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清。采用酶聯免疫吸附法檢測外周血白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18表達水平。所有操作按試劑盒說明書(賽默飛世爾科技有限公司，IL-1β、IL-18檢測試劑的批號分別為BMS224-2、A35613)嚴格執行。

1.3.2 DNA提取：使用抗凝管采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血約3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清。使用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒(RTG2402)，嚴格按照試劑盒標準步驟提取DNA；將樣本DNA稀釋至50 ng/μL，并存于-80℃冷庫備用。

1.3.3 TaqMan探針法檢測SNP分型：檢測儀器為ABI公司QuantStudioTM6型實時熒光定量PCR 儀；通用型PCR預混液(批號：4401857)、孔板(批號：4483343)、探針(批號：4333760F)等均由ABI公司提供。rs4612666上游引物為5′-AGATGGTGGTGGTGATGGTT-3′，下游引物為5′-ACCTGCCACTGCCTCTACTC-3′。具體操作步驟：(1)每孔反應液體系為10 μL通用型PCR預混液配1 μL探針，配置時實際試劑量比理論試劑量多10%～15%，混勻預混液。(2)把預混液分裝到光學96孔板中(避光環境下)，每孔11 μL，每孔加基因組DNA 11 μL。(3)加樣后使用光學封板膜封板，離心(4℃，2 000 r/min)60 s，將96孔板放置于實時熒光定量PCR儀上，擴增條件為60℃ 30 s、95℃ 10 min；95℃ 15 s、 60℃ 60 s，共40個循環。采用 Chromas 軟件讀取結果并分析。

1.4 統計學分析 使用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗或t′檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用χ2檢驗評估基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用非條件Logistic回歸分析NLRP3 炎癥小體基因位點rs4612666與肺癌遺傳易感性的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料及血清炎癥指標的比較 兩組一般資料差異均無統計學意義(均P>0.05)；觀察組血清IL-1β、IL-18表達水平均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及血清炎癥指標的比較

2.2 NLRP3 rs4612666位點基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗 兩組NLRP3位點rs4612666基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05) ，提示選擇的樣本具有群體代表性。見表2。

表2 NLRP3基因位點rs4612666 基因型分布Hardy-Weinberg 平衡檢驗(n)

2.3 兩組rs4612666基因型和等位基因頻率分布比較 兩組rs4612666位點基因型分布差異有統計學意義(P<0.05)；觀察組T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組NLRP3基因位點rs4612666基因型和等位基因頻率分布的比較[n(%)]

2.4 NLRP3 rs4612666位點基因型及等位基因與肺癌易感性的相關性 采用Logistic回歸模型，校正性別、年齡等因素后，結果顯示TT 基因型為肺癌的易感基因型[OR(95%CI)=1.294(0.675～2.479)，P=0.015]，攜帶T等位基因是發生肺癌的危險因素[OR(95%CI)=1.612(1.060～2.451)，P<0.001]。

3 討 論

目前，腫瘤相關性炎癥已成為學術界公認的腫瘤第7種生物學特性，長期反復的慢性炎癥是引起細胞惡變最終導致腫瘤形成的重要原因。炎癥反應可破壞組織的基因穩定性，造成基因突變，激活原癌基因，從而促進腫瘤發生與發展；同時，腫瘤發生后又可加劇其生長微環境中的炎癥反應[7]，造成惡性循環。本研究結果顯示，觀察組血清IL-1β、IL-18水平均高于對照組(P<0.05)，提示IL-1β、IL-18參與的炎癥反應在肺癌的發生、發展過程發揮重要作用，有學者推測炎癥小體可能在其中扮演了重要角色[8]。炎癥小體是由多種蛋白參與組裝形成的一種大分子復合體，在固有免疫系統中扮演重要角色。研究證實，NLRP3是在肺癌組織中主要表達的炎癥小體亞型之一[9]。在感染或組織損傷早期，炎癥小體對炎癥反應的平衡和穩態有調節作用[10]。在微環境中各種因素的長期刺激下，炎癥小體的組成蛋白如胱天蛋白酶原-1、IL-1β前體及IL-18前體等啟動轉錄翻譯；同時在外界微環境中的另一些因素刺激下， 胱天蛋白酶原-1被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，進一步剪切IL-1β前體、IL-18前體，使炎癥因子 IL-1β、IL-18被釋放[11]。大量研究結果提示，燃煤造成的空氣污染很可能為云南省宣威地區肺癌高發的主要環境風險因素，該地區煤炭燃燒后可產生較高濃度的二氧化硅、多環芳烴和苯并(α)芘等致癌物，且該地區室內PM10具有較強的氧化損傷能力[12-13]，而二氧化硅晶體、多環芳烴可誘導 NLRP3 炎癥小體活化[14]。此外，多環芳烴在人體內的某些代謝產物可與DNA共價形成多環芳烴-DNA，導致DNA損傷，引起基因突變，增強 NLRP3的表達，進而誘發腫瘤[15-16]。但是，在相同的暴露環境中不同個體間的患病風險差異很大，部分人罹患肺癌，而部分人卻安然無恙，有學者指出這可能與個體的易感性有關[17]。

NLRP3炎癥小體基因rs4612666位點位于1號染色體，T>C為第 7 號內含子變異；而堿基T突變會增強NLRP3的表達，激活被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，引起細胞凋亡[18]。檀潤先[19]發現，NLRP3位點rs4612666 等位基因頻率與胃癌的遺傳易感性相關，野生堿基T的攜帶者更容易罹患胃癌。國外研究表明，rs4612666的T等位基因與大動脈粥樣硬化引起的腦梗死及微栓子的發病風險增加相關[20]。本研究結果顯示，兩組rs4612666位點基因型分布比例、等位基因頻率差異有統計學意義(P<0.05)，且進一步行Logistic回歸分析發現TT基因型屬于宣威肺癌的易感基因型(P<0.05)，T 等位基因的攜帶者更容易患上肺癌(P<0.05)。筆者推測，NLRP3基因位點rs4612666的突變可能是通過調節細胞凋亡而導致組織化生及肺癌的發生。

綜上所述，云南省宣威地區肺癌患者的T等位基因頻率高于健康人群，炎癥小體NLRP3的基因多態性可能與該地區居民肺癌遺傳易感性密切相關。因此，可通過基因水平篩查和外周血相關指標的監控，對攜帶T等位基因的群體進行重點追蹤和及早干預，減少該群體的患病風險。本研究的樣本量小，結果可能會產生一定偏倚，因此仍需更深入的研究予進一步證實所得結論。