β-欖香烯對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活力及血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的影響▲

周 赟 陳 俊 李麗華 孫一洲 陳 蕾

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，遼寧省沈陽市 110001，電子郵箱：zhyun929@163.com)

β-欖香烯是一種二類非細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥，從中草藥香茅草中提取而得，毒副作用輕且抗腫瘤譜廣，廣泛應(yīng)用于肺癌、消化道腫瘤及其他淺表性腫瘤的治療[1-2]。研究證實，β-欖香烯可以通過兩種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖：一是通過上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[3-4]，二是通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移[5]。許多血管性眼科疾病的視網(wǎng)膜中VEGF表達(dá)顯著提高[6]，因此β-欖香烯是否可應(yīng)用于眼科領(lǐng)域疾病的治療成為研究熱點。耿金等[7]的研究結(jié)果顯示，β-欖香烯注射乳可以抑制氧誘導(dǎo)的新生血管模型小鼠視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展。而β-欖香烯注射乳對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果及其對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的作用鮮見研究報告。本研究將不同濃度的β-欖香烯作用于高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞，分析β-欖香烯對高糖環(huán)境下人RPE細(xì)胞活力及VEGF表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑 人RPE細(xì)胞株ARPE-19(ATCC公司，批號：AC337713)，β-欖香烯(大連遠(yuǎn)大生物集團(tuán))，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；海克隆公司，批號：SH30022.01B)，胎牛血清(海克隆公司，批號：SV30087.02)，胰蛋白酶(海克隆公司，批號：SH30042.01B)，MTS溶液(美國Promega公司，批號：CTB169)，人VEGF酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(達(dá)優(yōu)公司，批號：CT579-10)，細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(康寧公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取人RPE細(xì)胞株ARPE-19、在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，用2.5 g/L胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，消化時間為2 min。

1.3 MTS法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期ARPE-19細(xì)胞，采用胰蛋白酶進(jìn)行消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×104個/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為(1)對照組：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞；(2)高滲組：用加入27.5 mmol/L甘露醇的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞；(3)高糖組：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞；(4)高糖+不同濃度β-欖香烯組：分別向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中加入不同濃度β-欖香烯，β-欖香烯濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL，分別記為高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組、高糖+80 μg/mL β-欖香烯組、高糖+160 μg/mL β-欖香烯組。每組設(shè)置5個復(fù)孔，實驗孔周圍加入無菌磷酸緩沖鹽溶液以減少樣品蒸發(fā)；給予相應(yīng)干預(yù)后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別干預(yù)12 h、24 h、36 h、48 h后小心吸去上清，在電鏡下觀察細(xì)胞密度和形態(tài)，并且選取培養(yǎng)時間為24 h的ARPE-19細(xì)胞拍照留存。觀察細(xì)胞形態(tài)后每孔加入20 μL MTS溶液，繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀(博科生物，型號：BIOBASE4001)檢測各孔490 nm波長處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.4 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量 取對數(shù)生長期ARPE-19細(xì)胞，以5×105個/孔細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中(培養(yǎng)板每孔放入預(yù)先滅菌處理的蓋玻片)，每孔2.5 mL。將6孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為(1)對照組：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞；(2)高糖組：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞；(3)高糖+20 μg/mL β-欖香烯組：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中加入20 μg/mL β-欖香烯；(4)高糖+40 μg/mL β-欖香烯組：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中加入40 μg/mL β-欖香烯。給予相應(yīng)干預(yù)后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h和48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。于酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣本的VEGF水平對應(yīng)值,實驗重復(fù)6次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，方差不齊時比較采用非參數(shù)檢驗，重復(fù)測量計量資料的比較采用重復(fù)測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組ARPE-19細(xì)胞的鏡下形態(tài)變化 鏡下可見，對照組ARPE-19細(xì)胞以長梭形或三角形為主，胞體不透明，細(xì)胞排列緊密； 高滲組ARPE-19細(xì)胞形態(tài)和對照組類似；高糖組ARPE-19細(xì)胞排列稀疏，胞體變薄，胞內(nèi)空泡變多，不規(guī)則細(xì)胞增多，形態(tài)表現(xiàn)多樣；高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)明顯優(yōu)于高糖組，排列較高糖組緊密，細(xì)胞形態(tài)為梭形；高糖+80 μg/mL β-欖香烯組 ARPE-19細(xì)胞形態(tài)與高糖組類似；高糖+160 μg/mL β-欖香烯組ARPE-19細(xì)胞明顯腫脹變形，空泡增多，排列稀疏。見圖1。

對照組 高滲組 高糖組 高糖+10 μg/mL β-欖香烯組

2.2 β-欖香烯對高糖環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞活力的影響 8組ARPE細(xì)胞活力吸光度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=15.990，P組間<0.001)，均有隨時間變化的趨勢(F時間=159.870，P時間<0.001),分組與時間存在交互效應(yīng)(F交互=2.520，P交互=0.003)。其中在作用12 h、24 h、36 h、48 h時，高糖組ARPE細(xì)胞活力吸光度值較對照組下降(P<0.05)；在作用24 h、36 h、48 h時，高糖+10 μg/mLβ-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組、高糖+80 μg/mL β-欖香烯組ARPE細(xì)胞活力吸光度值較高糖組升高(P<0.05)。見表1。我們發(fā)現(xiàn)作用時間為24 h，β-欖香烯作用濃度為20 μg/mL時ARPE細(xì)胞的吸光度值大于其他組細(xì)胞(P<0.05)，因此后續(xù)ELISA檢測選定的β-欖香烯作用時間為24 h和48 h，作用濃度為20 μg/mL、40 μg/mL。

表1 各時間點8組ARPE細(xì)胞活力吸光度值(x±s)

2.3 β-欖香烯對高糖環(huán)境下ARPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)的影響 在作用24 h、48 h時，4組ARPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。高糖組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、對照組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組ARPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表2。各組作用48 h時ARPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)量均高于作用24 h的表達(dá)量(均P<0.05)。

表2 各組ARPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

隨著人們生活方式的改變和社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，近年來糖尿病的發(fā)病率和患病率呈持續(xù)增長趨勢[8]。眾所周知，糖尿病以及隨之而來的各種并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類健康，其中，糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，每年因其導(dǎo)致失明的患者超過10 000例[9]。糖尿病性視網(wǎng)膜病變的基本病理改變是血-視網(wǎng)膜屏障破壞、新生血管和纖維增殖膜的生成，其進(jìn)一步發(fā)展可引起玻璃體積血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重影響視力，甚至導(dǎo)致失明，而干預(yù)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展是目前臨床面臨的難題。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的眼部新生血管形成促進(jìn)因子[10]，在糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用。在長期的高糖刺激下，視網(wǎng)膜各層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一系列的病理生理改變，其中RPE細(xì)胞是病變的中心環(huán)節(jié)之一，與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展，以及新生血管生成、纖維增殖膜的形成密切相關(guān)[11]。RPE細(xì)胞層處于富含血管的脈絡(luò)膜以及視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間，是視網(wǎng)膜的外屏障，其所含有大量的葡萄糖載體可運(yùn)送葡萄糖至視網(wǎng)膜外層，滿足視細(xì)胞高代謝活動對能量的需求，同時血糖波動對其影響較大[12]。所以，深入了解RPE細(xì)胞在病理情況下的異常生物學(xué)行為可為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療的研究奠定理論基礎(chǔ)[13]。

目前在臨床中，已有幾種抗VEGF藥物得到了廣泛應(yīng)用，但由于費(fèi)用昂貴，許多患者無法承受長期抗VEGF治療。有研究顯示，藏藥小檗皮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，機(jī)制與其抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)[14]。β-欖香烯是一種二類非細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥，從中草藥香茅草中提取而得，價格相對低廉、毒副作用輕且抗腫瘤譜廣。研究顯示，β-欖香烯可下調(diào)人涎腺腺樣囊腺癌、肺腺癌及喉鱗癌細(xì)胞中VEGF及其受體的表達(dá)水平，故推斷β-欖香烯可能通過抑制VEGF的表達(dá)從而抑制腫瘤局部血管生成[15-16]。李悅等[17]的研究證實，β-欖香烯可以直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及阻斷細(xì)胞周期，降低細(xì)胞的生成血管能力。還有研究表明，β-欖香烯可以和放療協(xié)同抑制VEGF的表達(dá)，從而改善腫瘤的新生血管形成情況，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[18]。 另外，顏兵等[19]通過體內(nèi)、體外實驗發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可通過抑制VEGF及VEGF受體3的表達(dá)降低淋巴管密度，且具有劑量依賴性，這可能是其防止胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。Chen等[5]的實驗研究證實，β-欖香烯通過抑制VEGF的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制黑色素瘤生長轉(zhuǎn)移的作用。而在眼科研究領(lǐng)域中，趙婉君等[20]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯通過促進(jìn)微小RNA-27a的表達(dá)和抑制VEGF的表達(dá)，對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管模型小鼠的視網(wǎng)膜發(fā)揮抑制新生血管形成的作用。故筆者猜測β-欖香烯在糖尿病視網(wǎng)膜病變中也具有抑制新生血管形成的作用。鑒于VEGF是作用最強(qiáng)的眼部新生血管形成促進(jìn)因子，且本課題組前期研究已證實β-欖香烯可以抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)[21]，因此本研究選取人RPE細(xì)胞，經(jīng)高糖處理后加入β-欖香烯，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達(dá)情況。

本研究結(jié)果顯示，在作用12 h、24 h、36 h、48 h時，高糖組人RPE細(xì)胞吸光度值較對照組下降(P<0.05)，但高滲組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在作用24 h、36 h、48 h時，高糖+10 μg/mL β-欖香烯組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組人RPE細(xì)胞吸光度值較高糖組升高(P<0.05)。這提示高滲對RPE細(xì)胞活力影響不大，但高糖可顯著降低細(xì)胞活力，而采用β-欖香烯進(jìn)行干預(yù)可以提高細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)作用時間為24 h，β-欖香烯作用濃度為20 μg/mL時人RPE細(xì)胞的活力大于其他組，因此后續(xù)ELISA檢測選定的β-欖香烯作用時間為24 h和48 h，作用濃度為20 μg/mL、40 μg/mL。ELISA檢測結(jié)果顯示，各組作用48 h時人RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)水平均高于作用24 h(P<0.05)；作用24 h、48 h時，高糖組、高糖+20 μg/mL β-欖香烯組、對照組、高糖+40 μg/mL β-欖香烯組人RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)。這說明隨著作用時間的延長及作用濃度的增加，β-欖香烯對高糖環(huán)境下分泌型VEGF蛋白抑制作用逐漸增強(qiáng)。所以我們推測β-欖香烯在一定濃度范圍內(nèi)可改善高糖環(huán)境下人RPE細(xì)胞的活力，并且降低人RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達(dá)，且存在一定的時效關(guān)系及量效關(guān)系。

綜上所述，一定濃度的β-欖香烯可改善高糖環(huán)境下人RPE細(xì)胞的活力，并且降低VEGF蛋白的表達(dá)，但其中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。