合并阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的結直腸癌患者的腸道菌群狀況及其慢性間歇性缺氧狀況與病理特征的關系▲

何 斌 薛 珉 余蘇云 貝頌華 高習文

(復旦大學附屬閔行區中心醫院1 呼吸內科，2 內鏡中心，上海市 201199，電子郵箱：hebing20190@126.com)

結直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，2019年國家癌癥中心發布的最新數據顯示，在農村、城市其發病率分居惡性腫瘤譜的第5位、第2位，且呈逐漸上升、年輕化趨勢[1]。盡管近年來診療技術和靶向藥物快速發展，但結直腸癌患者的預后依然不理想，中位生存時間僅為30個月[2]。間歇性缺氧是阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAHS)的重要特征[3]。研究表明，間歇性缺氧所致的氧化應激反應和缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)表達水平的升高與腫瘤的發生和發展密切相關[4]。OSAHS可通過間歇性缺氧影響結直腸癌的病理生理特征，但具體機制仍未完全闡明[5]。因此，本研究探討合并OSAHS的結直腸癌患者的腸道菌群狀況及其慢性間歇性缺氧狀況與病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月至2018年12月間在我院就診或體檢的100例患者或體檢者作為研究對象，其中健康者(對照組)、結直腸癌合并OSAHS患者(結直腸癌+OSAHS組)、單純結直腸癌患者(結直腸癌組)、單純OSAHS患者(OSAHS組)各25例。結直腸癌患者入組標準：(1)所有患者均經手術病理確診，且臨床資料齊全；(2)術前未接受放化療或其他抗腫瘤治療；(3)排除合并其他腫瘤及心肝腎等重要器官嚴重功能不全者。OSAHS患者入組標準：(1)OSAHS診斷符合中華醫學會呼吸病學分會制定的診斷標準[6]；(2)睡眠呼吸紊亂指數≥40次/h；(3)排除慢性阻塞性肺疾病患者、心肝腎等重要器官嚴重功能不全者。各組的性別構成比、年齡等差異均無統計學意義(均P>0.05)，結直腸癌+OSAHS組與結直腸癌組患者在Dukes分期、分化程度、淋巴結轉移等方面差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究符合《赫爾辛基宣言》的倫理學要求，患者或家屬均簽署知情同意書。

表1 4組一般資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 病理資料收集：結直腸癌患者均于術中留取腫瘤病灶組織標本，送病理檢查，明確Dukes分期、分化程度、淋巴轉移等情況。

1.2.2 糞便腸道菌群計數及種類鑒定：(1)收集所有研究對象的適量新鮮糞便，30 min內送檢，其中結直腸癌患者在術前3 d采集，其余研究對象在腸鏡檢查前3 d采集。(2)稱取0.1 g糞便標本置于EP管，加入0.9 mL生理鹽水混勻，倍比稀釋，依次稀釋10倍、102倍、103倍；將不同稀釋度的標本分別接種于需氧菌、厭氧菌培養基上進行初次分離培養，其中需氧菌培養條件為37℃(18～24 h)，厭氧菌培養條件為37.5℃(24～48 h)；在相應時間內若未見菌落生長，則繼續按原條件培養至1周。確定平板上的目的菌后，利用平板計數法對菌株進行計數；根據平板活菌計數和稀釋倍數，按下列公式計算活菌計數，活菌數量=lg[每毫升糞便標本活菌集落數量(CFU/mL)]，每毫升糞便標本活菌集落數量(CFU/mL)=(標本質量+稀釋量)/標本質量×稀釋倍數×菌落個數[7]；以稀釋倍數102倍計算所得為最終結果。

1.2.3 免疫組化檢測：(1)通過手術或腸鏡檢查采集所有研究對象的結直腸組織樣本，其中結直腸癌患者的標本包括腫瘤病灶組織及病灶周圍3 cm外的癌旁組織，對照組、OSAHS組腸鏡檢查時取結直腸黏膜標本(升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸各取活檢2塊)。(2)采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化酶連結法染色，具體操作如下：取得結直腸組織樣本后，經甲醛固定、石蠟包埋，制作厚度為3 μm的組織切片4張，常規脫蠟、水化、抗原修復后加入3% H2O2，室溫孵育10 min，再用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；將切片置于1.0%枸櫞酸緩沖液持續煮沸2 min后取出冷卻，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；加入山羊血清37℃孵育15 min，加入一抗HIF-1免疫組化單克隆抗體(美國Sigma公司，批號：131105554F)、谷氨酰胺酶2(glutaminase 2，GLS2)免疫組化單克隆抗體(美國Sigma公司，批號：1303189902)，37℃孵育60 min；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；滴加新鮮配制的3,3′-二氨基聯苯胺顯色(福州邁新生物技術開發有限公司，批號:81215710)15 min，自來水沖洗10 min終止反應，再復染、脫水、透明、封片。(3)為了排除假陽性和假陰性，采用HIF-1、GLS2陽性的結直腸組織切片作為陽性對照，采用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗作為陰性對照。所有標本均由兩名高年資病理醫師進行評估；如意見不統一，則由第3名病理醫師共同商討得出統一結論。(4)采用半定量分級計分方法[8]評估HIF-1、GLS2的表達情況：HIF-1、GLS2蛋白均主要位于細胞質，陽性染色表現為淡黃色至棕褐色；染色強度計分標準為無色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽性細胞占比計分標準為≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；以染色強度計分與陽性細胞占比得分的乘積作為陽性系數，陽性系數為0～1分判定為該因子陰性表達，陽性系數≥2分則判定為該因子陽性表達。

1.3 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析或t檢驗，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間比較采用F′檢驗，兩兩比較采用Welch檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或確切概率法，兩兩比較采用Bonferroni校正法。以P<0.05為差異有統計學意義；采用Bonferroni校正法時，檢驗水準=0.05/K，K為比較的次數。

2 結 果

2.1 4組主要腸道菌群的活菌集落數 本研究主要鑒定出5種腸道細菌，分別是乳酸桿菌、脆弱擬桿菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌、糞腸球菌。4組主要腸道菌群的活菌集落數差異均有統計學意義(均P<0.05)；其中，結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組、OSAHS組、對照組的乳酸桿菌集落數依次升高，大腸埃希菌集落數依次降低；結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組的脆弱擬桿菌、糞腸球菌集落數均高于OSAHS組、對照組，雙歧桿菌集落數均低于OSAHS組、對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 4組腸道菌群分布情況的比較(x±s，CFU/mL)

2.2 各組HIF-1、GLS2的陽性率比較 與對照組比較，結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組、OSAHS組的HIF-1、GLS2表達陽性率均升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組HIF-1、GLS2陽性率的比較[n(%)]

2.3 結直腸癌患者癌組織及癌旁組織HIF-1、GLS2的陽性率的比較 結直腸癌+OSAHS組和結直腸癌組中，與癌旁組織比較，結直腸癌組織HIF-1、GLS2陽性率均升高(均P<0.05)。見表4。

表4 結直腸癌患者癌組織及癌旁組織HIF-1、GLS2的陽性率的比較[n(%)]

2.4 結直腸癌+OSAHS組患者HIF-1、GLS2的表達與臨床病理特征的關系 浸潤深度≥T2期、Dukes分期為C～D期、合并淋巴結轉移的結直腸癌+OSAHS患者的GLS2陽性率升高，合并淋巴結轉移的結直腸癌+OSAHS患者的HIF-1陽性率升高(均P<0.05)。見表5。

表5 結直腸癌+OSAHS組患者HIF-1、GLS2陽性率與臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討 論

近年來，OSAHS發病率不斷升高，成人OSAHS患病率高達4%，60歲以上人群患病率可高達20%～40%，該病嚴重影響患者的生活工作質量，對健康和生命具有極大危害[9]。OSAHS的病理生理特征表現為睡眠中氣道塌陷阻塞、氣流受限，引起反復間歇性缺氧、二氧化碳潴留、睡眠片段化，造成內分泌功能紊亂、神經調節功能失衡、血流動力學改變及微循環異常等變化，最終導致多系統器官功能損害；由于機體的保護性反應，OSAHS患者夜間可出現反復覺醒、通氣加快，這使得間歇性缺氧癥狀可獲得緩解，但入睡后再次出現間歇性缺氧。這種缺氧/復氧過程類似于缺血/再灌注狀態，可引起機體產生大量活性氧簇，進而誘發HIF-1、GLS2等對氧化還原敏感的轉錄因子表達增加，促發炎癥因子聚集，加重氧化應激反應[10]。

腸道菌群具有腸黏膜生物屏障的作用，在食物消化與吸收、腸黏膜上皮細胞增殖更新、抵抗病原體及炎性反應等方面發揮關鍵性作用；當腸道菌群失調時，腸黏膜上皮細胞與腸道微環境將出現功能性變化，可誘發結直腸癌等多種疾病[11]。OSAHS可促進腫瘤的發生、發展[12]。Martínez-García等[13]通過多中心臨床研究對OSAHS患者隨訪發現，有9.4%患者被確診為癌癥，其癌癥發病率遠高于普通人群，但其具體機制仍有待研究。最近有研究顯示，間歇性缺氧可改變腸道菌群的多樣性：研究者通過構建間歇性缺氧小鼠模型來模擬OSAHS，飼養6周后取糞便進行菌群分析，發現與正常對照小鼠比較，間歇性缺氧小鼠的糞便出現菌群多樣性和構成改變，其中擬桿菌、變形桿菌相對減少而硬壁菌群相對增加[14]。本研究結果顯示，結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組、OSAHS組、對照組的乳酸桿菌集落數依次升高，大腸埃希菌集落數依次降低，結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組的脆弱擬桿菌、糞腸球菌集落數均高于OSAHS組、對照組，雙歧桿菌集落數均分別低于OSAHS組、對照組(均P<0.05)，即結直腸癌+OSAHS組腸道菌群異常和微生態紊亂更為明顯，厭氧菌與需氧菌比例失衡，這表明OSAHS可促進結直腸癌患者的腸道菌群紊亂。同時，結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組及OSAHS組的HIF-1、GLS2陽性表達率均高于對照組，且結直腸癌+OSAHS組、結直腸癌組腫瘤病灶組織的HIF-1、GLS2陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，這與鄧立勇等[15]的研究結果相似。已有研究證實，腸道菌群與炎癥的發生關系密切，在炎癥刺激下可通過產生活性氧自由基誘發結腸黏膜的氧化應激反應，并通過HIF-1、GLS2等促進炎癥細胞聚集，從而造成DNA損傷，進而激活癌基因或抑制抑癌基因，最終導致癌癥的發生[16]。有研究顯示，腸道菌群的變化可通過促進腸上皮細胞中內源性細胞因子白細胞介素17C過表達來影響下游Toll樣受體/髓樣分化因子信號通路，從而誘發結直腸組織發生癌變[17]。進一步分析發現，隨結直腸癌浸潤深度的增大、Dukes分期增高或出現淋巴結轉移，結直腸癌+OSAHS組患者GLS2陽性率明顯升高，而合并淋巴轉移的結直腸癌+OSAHS組患者HIF-1陽性率明顯升高(P<0.05)。研究表明，HIF-1、GLS2參與了腫瘤細胞的血管形成、增殖凋亡和侵襲轉移，促進腫瘤的惡性進展，且HIF-1能通過調控GLS2表達等多種途徑誘導腫瘤細胞產生耐藥，從而削弱患者治療效果[18]。這提示OSAHS所致慢性間歇性缺氧可能與結直腸癌患者的病理特征甚至預后密切相關。

綜上所述，合并OSAHS的結直腸癌患者存在明顯的腸道菌群紊亂，OSAHS可能通過影響腸道菌群引起結直腸癌，并與結直腸癌的病理特征密切相關。