兩種表面活性劑對玫煙色棒束孢PF904菌株侵染小菜蛾幼蟲的影響

王宏民, 趙義濤, 郭 恒, 張仙紅,*

(1. 山西農業大學農業經濟管理學院, 山西太谷 030801; 2. 山西農業大學植物保護學院, 山西太谷 030801)

小菜蛾Plutellaxylostella為十字花科蔬菜的主要害蟲，是目前農業害蟲中交互抗藥譜最廣、抗性水平最高、抗性發展速度最快的害蟲之一。因此，應用新型生物農藥防治小菜蛾已成為必然的趨勢。蟲生真菌是一類重要的昆蟲病原微生物，在持續控制害蟲、保護生態平衡方面發揮著重要作用。玫煙色棒束孢Isariafumosoroseus作為一種重要的蟲生真菌，能寄生鱗翅目、鞘翅目和膜翅目等8目的多種有害昆蟲(Zimmermann, 2008)。但由于其殺蟲速度緩慢、防效不穩定等因素，嚴重制約了其在害蟲防治中的應用。蟲生真菌孢子在昆蟲體表的成功附著和萌發是其侵染害蟲的關鍵，但由于孢子懸浮液潤濕性和分散性差，直接噴施于靶標植物和害蟲時，在植物和蟲體表面的附著率低，從而導致蟲生真菌侵染率降低、殺蟲速度下降。因此如何提高真菌孢子在植物表面的穩定持留量及蟲體體表的附著率是提高蟲生真菌防治效率的關鍵。

表面活性劑是殺蟲劑中除載體之外的最重要的一類助劑(姜虹等, 2020)，它可通過降低藥液的表面張力和接觸角(Wirthetal., 1991; 顧中言等, 2006)，提高殺蟲劑在靶標植物上的穩定持留量，從而提高其有效利用率(朱金文等, 2004; 閻世江等, 2017)，目前在化學殺蟲劑的生產中得到了廣泛的應用。據施辰子等(2009)報道，井岡霉素、殺蟲單等可溶性粉劑及井岡·蠟芽菌、甲維·毒死蜱等復配農藥中添加高活性9708表面活性劑，顯著減少農藥流失，防蟲效果提高12%～26%；啶菌噁唑中添加烷基酚聚氧乙烯醚(NP-7)和辛基苯基聚氧乙烯醚(Triton X-100)等表面活性劑顯著提高了其防效(劉鵬飛等, 2010)；高效氯氟氰菊酯中加入有機硅表面活性劑，顯著提高了對螺旋粉虱Aleurodicusdispersus的防治效果，毒效比達6.07(黃超福等, 2010)；有機硅表面活性劑Silwet 618可使啶蟲脒防治蚜蟲的增效作用提高210.2倍(李北興等, 2017)；咪草煙中添加有機硅表面活性劑Silwet L-77可顯著提高其毒力(Reddy and Singh, 1992; Singh and Singh, 2008)。可見，表面活性劑有效提高了化學農藥的利用效率，但表面活性劑是否會提高蟲生真菌對靶標害蟲的防效目前還未見報道。

我們的前期研究表明，添加125 mg/L的聚二甲基硅氧烷(OFX-0193)和250 mg/L的二異丁基萘磺酸鈉(Nekal)表面活性劑后明顯提高了玫煙色棒束孢Isariafumosoroseus在小菜蛾寄主植物葉片上的穩定持留量，并對真菌孢子的活性無影響(趙義濤等, 2020)。那么添加表面活性劑是否也會改善玫煙色棒束孢孢子在小菜蛾幼蟲體表的附著量，提高其防治效果?為此，本研究采用掃描電鏡，觀察了添加OFX-0193和Nekal這兩種表面活性劑后玫煙色棒束孢孢子懸浮液在小菜蛾幼蟲體表不同部位的孢子附著量、孢子的萌發速率及侵染過程，從而為提高蟲生真菌的有效利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為山西農業大學昆蟲重點實驗室人工氣候箱利用甘藍葉片飼養多代的小菜蛾，飼養條件：溫度26±1℃，相對濕度75%～80%，光周期14L∶10D。取個體大小一致、健康的3齡幼蟲供試。

1.2 孢子懸浮液的制備

將4℃下貯存的玫煙色棒束孢PF904菌株在室溫下活化1 d，接種到PDA培養基上培養10 d后，用接菌針把孢子慢慢刮下，用清水反復沖洗，渦旋振蕩器打散15 min，兩層紗布過濾菌絲，制成濃度為2×107孢子/mL的孢子懸浮液。將前期篩選出的表面活性劑OFX-0193和Nekal添加到玫煙色棒束孢PF904菌株孢子懸浮液中，分別配制為含OFX-0193(終濃度125 mg/L)和Nekal(終濃度250 mg/L)的2種孢子懸浮液(2×107孢子/mL)；以添加清水的孢子懸浮液(2×107孢子/mL)為對照。

1.3 供試藥液侵染的小菜蛾幼蟲感病癥狀觀察

采用坡塔噴霧器將1.2節制備的供試菌液及對照分別噴施于小菜蛾3齡幼蟲體表，接菌后在26±1℃和相對濕度75%±5%條件下飼養，定時更換新鮮甘藍葉片。每處理3次重復，每重復20頭幼蟲。接菌后每12 h觀察1次小菜蛾幼蟲的感病癥狀。

1.4 小菜蛾幼蟲體表孢子附著及萌發情況的掃描電鏡觀察

小菜蛾3齡幼蟲的接菌及飼養方法同1.3節，接菌3 h后取樣一次，分別在小菜蛾幼蟲體表各結構區隨機選取(1×1) mm2統計孢子數量，每個區域重復5次，并計算平均值，統計小菜蛾幼蟲體表不同部位的玫煙色棒束孢PF904孢子附著量。

此后每12 h取樣1次，觀察小菜蛾幼蟲體表不同部位玫煙色棒束孢PF904孢子萌發情況。樣品用2.5%的戊二醛-磷酸緩沖液固定，放入4℃的冰箱過夜，依次用70%, 80%, 85%, 90%和95%的乙醇溶液對其進行梯度脫水，每次脫水15 min，各濃度重復脫水3次，用100%的乙醇脫水2次，每次15 min，最后用丙酮置換30 min，系列處理后，將干燥后的小菜蛾幼蟲用雙面導電膠固定在掃描電鏡的樣品臺上，日立E-1010離子濺射儀噴金鍍膜，在掃描電鏡(S-4800；日本日立公司)下拍照觀察。

1.5 添加不同表面活性劑的孢子懸浮液對小菜蛾致病力的測定

挑選個體大小、活力一致的小菜蛾3齡幼蟲，采用坡塔噴霧器將1.2節配制的添加表面活性劑OFX-0193(125 mg/L)和Nekal(250 mg/L)的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液和對照分別噴施于小菜蛾幼蟲體表，置于皿底墊有濕潤濾紙片的直徑9 cm的培養皿中，于26±1℃和75%～80%相對濕度下進行飼養，并用吸足標準十字花科營養液的棉球包裹甘藍葉片的葉柄。每處理20頭幼蟲，重復5次。接菌后每12 h觀察1次，記錄蟲體感病癥狀和死亡蟲數，計算死亡率、化蛹率和致死中時(LT50)，收集的死蟲(證明幼蟲是被玫煙色棒束孢菌絲致病而死)置于滅菌培養皿內，25℃保濕培養，未感病的幼蟲(用于觀察對照組與處理組中的畸形蛹)飼養至羽化為止。

1.6 數據分析

利用Adobe Photoshop CS6處理圖片，使用DPS7.05軟件進行數據統計分析，差異顯著性檢驗用LSD法，顯著性水平設定為P<0.05。

2 結果

2.1 小菜蛾3齡幼蟲感染添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株后的感病癥狀

圖1 小菜蛾3齡幼蟲感染玫煙色棒束孢PF904菌株不同時期的外部癥狀

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液處理小菜蛾幼蟲后，蟲體的感病癥狀如圖1所示。在染病初期，蟲體的外部形態、取食和對外界刺激的反應等均與未感病幼蟲無差別。接菌12 h，對照組蟲體體表未見黑斑(圖1: A)，而處理組蟲體體表局部出現針孔般大小的黑斑(圖1: D)；接菌24 h，對照組中蟲體體表出現少量黑斑(圖1: B)，而處理組黑斑明顯增多，且部分蟲體頭部向上翹起，身體產生不正常的抽搐行為(圖1: E)；接菌36 h，處理組感病幼蟲體色為黃褐色，蟲體呈油浸狀，幼蟲取食明顯減少或停止取食，對外界刺激反應明顯遲鈍，腹側的黑化斑點全面擴散(圖1: G)；接菌72 h，處理組部分蟲體發生皺縮(圖1: H)，少數感病蟲體瀕臨死亡，部分蟲體化蛹時間提前，且多數為畸形蛹(圖1: F)，化蛹后很快死亡。接菌96-144 h后，死亡蟲尸僵化，體表被粉白色氣生菌絲覆蓋(圖1: I)。

2.2 表面活性劑對小菜蛾3齡幼蟲體表不同結構區玫煙色棒束孢PF904孢子附著量的影響

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液接菌到小菜蛾幼蟲體表后，孢子在小菜蛾幼蟲體表不同部位的附著量如表1所示。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的孢子懸浮液，其孢子在小菜蛾幼蟲體表刺狀突起結構區(圖2: D, G)的附著量分別為12.5和9.4個/mm2，在平緩結構區(圖2: E, H)的附著量分別為16.2和12.4個/mm2，在嵴狀突起結構區(圖2: F, I)的附著量分別為30.1和24.8個/mm2；2種處理在小菜蛾幼蟲體表不同結構區的孢子附著量均顯著高于對照(圖2: A-C)，其中添加Nekal(250 mg/L)效果最佳，在小菜蛾幼蟲體表3種部位的孢子附著量分別為對照的2.19, 1.78和1.94倍，可見，供試的2種表面活性劑可顯著提高玫煙色棒束孢在小菜蛾幼蟲體表的孢子附著量。

2.3 表面活性劑對玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲體表不同結構區萌發和侵入的影響

玫煙色棒束孢對小菜蛾幼蟲體壁的侵染需經過分生孢子附著、萌發、產生芽管和附著胞及穿透體壁等過程(陳巍巍和馮明光, 1999)。掃描電鏡觀察顯示，以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液接菌12 h后，大量的分生孢子成功附著于幼蟲體表，部分孢子萌發并形成芽管(圖3: D, G)，而對照中的分生孢子未萌發(圖3: A)；接菌24 h后，對照中分生孢子開始萌發并形成芽管(圖3: B)，而添加表面活性劑的處理組中芽管出現膨大結構形成附著胞，部分孢子向雙向萌發后侵入幼蟲體腔(圖3: E, H)；接菌36 h后，添加表面活性劑明顯促進了菌絲的生長，處理組(圖3: F, I)菌絲長度顯著大于對照組的(圖3: C)； 接菌48 h后，蟲體表面附著大量萌發的菌絲。

表1 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲體表不同結構區的孢子附著量

圖2 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲體表不同結構區的孢子附著量

圖3 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株侵染不同時間在小菜蛾3齡幼蟲體表不同結構區的萌發和入侵過程

2.4 表面活性劑對玫煙色棒束孢PF904菌株對小菜蛾3齡幼蟲致病力的影響

由表2可知，添加不同表面活性劑后玫煙色棒束孢PF904菌株對小菜蛾幼蟲的毒力及致病速率存在顯著差異。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液比對照對小菜蛾3齡幼蟲的致病速率顯著提高，處理組幼蟲24 h后體表出現明顯的感病癥狀，72 h出現死亡高峰， Nekal(250 mg/L)處理組中的致死中時為2.71 d，OFX-0193(125 mg/L)處理組中的致死中時為2.95 d；而對照組在36 h后出現感病癥狀，96 h出現死亡高峰，致死中時為4.10 d(表2)。添加不同表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904使小菜蛾幼蟲的校正死亡率和化蛹率存在顯著差異(P<0.05)，Nekal(250 mg/L)處理組中小菜蛾幼蟲的校正死亡率可達79.2%，化蛹率為19.6%，且12.4%為畸形蛹；OFX-0193(125 mg/L)處理組中幼蟲的校正死亡率為65.7%，化蛹率為23.6%，可見玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液中添加這2種表面活性劑均可提高其致病力。

表2 添加不同表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株對小菜蛾3齡幼蟲的致病力

3 討論

表面活性劑可通過改善農藥藥液在靶標上的分布、附著、滲透等，降低藥液的表面張力，促進藥液在靶標表面的潤濕展布和沉積量，從而提高農藥的利用率(Taylor, 2011; Xuetal., 2011)。玫煙色棒束孢侵染靶標害蟲，需經過孢子附著-萌發-穿透體壁才能有效侵染害蟲，因此體壁上孢子的附著數量及萌發率是影響其致病力的主要因素。但由于昆蟲體壁為疏水性，水溶性的孢子懸浮液噴施后常易滾落而使蟲體表面孢子附著量減少。本研究結果表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性劑的玫煙棒束孢PF904菌株在小菜蛾幼蟲體表不同部位的孢子附著量為對照的1.36～2.19倍(圖2)。可見，供試的2種表面活性劑可顯著提高蟲生真菌玫煙色棒束孢孢子在小菜蛾幼蟲體表的附著量。

據趙義濤等(2020)報道，離體條件下，添加表面活性劑OFX-0193和Nekal對玫煙色棒束孢孢子的萌發有一定的促進作用。本研究表明，以添加表面活性劑125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal的玫煙色棒束孢孢子懸浮液處理小菜蛾3齡幼蟲后，蟲體表面出現黑斑的時間均比對照組顯著提前，且其他感病癥狀也明顯早于對照(圖1)。此外，室內生測試驗表明，添加表面活性劑OFX-0193和Nekal的處理組比對照對小菜蛾3齡幼蟲的致死中時縮短了1.39～1.51 d(表2)。這可能由于添加表面活性劑一方面提高了小菜蛾幼蟲體表的孢子附著量，同時也促進了孢子的萌發，因此顯著提高了玫煙色棒束孢對小菜蛾幼蟲的侵染速率。

據邱占奎等(2006)報道，10%吡蟲啉可濕性粉劑添加0.05%～0.1%表面活性劑Silwet408顯著提高了小麥蚜蟲的防治效果；單提升等(2019)研究表明，添加表面活性劑Greenwet 7618后，四氯蟲酰胺50%的推薦用量對菜青蟲仍有很好的防治效果。本研究表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性劑后，玫煙色棒束孢對小菜蛾3齡幼蟲的致死率均顯著高于對照(表2)。這與王靜和朱九生(2016)報道的添加表面活性劑Silwet 408和Silwet 312對阿維菌素防治小菜蛾具有增效作用及封云濤等(2017) 報道的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(ME)中加入有機硅表面活性劑Silwet 408可顯著提高其對小菜蛾防治效果的研究結果相一致。