中華按蚊氣味結合蛋白AsinOBP2的基因克隆、表達譜及與人體氣味物質的結合特性分析

張嘉俊, 何興菲, 張婷婷, 司風玲, 陳 斌, 何正波

(重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所, 媒介昆蟲重慶市重點實驗室, 重慶 401331)

吸食人血及傳播疾病的蚊蟲主要是按蚊屬Anopheles、伊蚊屬Aedes、曼蚊屬Mansonia和庫蚊屬Culex的部分種類(陸寶麟, 2000)。蚊蟲的吸血行為不僅騷擾、叮咬人畜，還傳播多種疾病，包括瘧疾、登革熱、西尼羅河病毒、基孔肯亞熱、黃熱病等，嚴重威脅著人類的健康(Caraballo and King, 2014)。感知和定位宿主是蚊蟲吸血行為中的關鍵環節，已有研究表明蚊蟲通過嗅覺、視覺、濕度和溫度等刺激來追尋宿主(Bar-Zeevetal., 1977; Bidlingmayer, 1994; Bernieretal., 1999, 2000; Chenetal., 2019)。其中，通過嗅系統覺感知宿主散發出的氣味物質，進而順著氣味源搜尋宿主，是蚊蟲定位宿主的主要方式(Bernieretal., 1999)。蚊蟲的嗅覺系統包含多種與嗅覺相關的功能蛋白，如氣味結合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)和離子型受體(ionotropic receptors, IRs)等(Leal, 2013)。氣味結合蛋白是昆蟲感知外界環境的基礎(Pelosietal., 2006)，能夠選擇性地結合并將環境中的氣味分子通過感器淋巴液運輸至位于嗅覺感覺神經元(olfactory sensory neurons, OSNs)膜上的ORs(王桂榮等, 2004)。

在長期的進化過程中，蚊蟲對宿主的偏好有明顯的分化，比如岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti嗜吸人血，而中華按蚊Anophelessinensis則兼吸人、畜血液。已有研究表明，宿主氣味物質的種類和含量差異是造成蚊蟲宿主偏好的重要原因之一(Patesetal., 2001; Qiuetal., 2006a; Omranietal., 2010; Verhulstetal., 2016)。通過氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS)鑒定人體氣味物質，發現人體不同部位氣味物質的數量和種類存在差異(吳德華等, 2003a, 2003b; 代勇等, 2009)。Bernier等(2000)采用GC/MS對人體皮膚氣味物質進行分析，共鑒定出277種成分，包括羧酸類、醇類、醛類、酰胺/胺類、酯類、鹵化物類、酮類、硫化物、鹵化物、硫酯類、雜環類、脂肪族化合物和芳香族類化合物等。通過行為和電生理測定，這些人體氣味物質中的一些組分在一定的劑量下能夠引起蚊蟲產生較強的電生理反應，并表現出引誘或驅避的效果(Mboeraetal., 1998; Purietal., 2006; Cooperbandetal., 2008; Seenivasaganetal., 2013; Guhaetal., 2014; Chenetal., 2019)。比如，在Y型管引誘實驗中，乳酸顯著吸引埃及伊蚊(Geier and Boeckh, 1999)，3-甲基-1-丁醇會顯著吸引岡比亞按蚊(Verhulstetal., 2011; Zohdyetal., 2015)，辛酸和吲哚在一定濃度下也呈現出對蚊蟲的引誘作用(余靜等, 2012)。致倦庫蚊Culexquinquefasciatus雌蚊對人體皮膚揮發物質的觸角電位和行為反應測定發現，C3-C13的羧酸均會在一定劑量下引起致倦庫蚊產生EAG反應，而C14-C18的羧酸不能引起EAG反應，C3, C6, C7, C8, C9, C11, C13和C14的羧酸能對雌蚊有吸引作用；丙三醇、乙二醇、苯甲醇、膽固醇、苯酚、正癸醇、苯甲醛、正庚醛、正丙醛和正壬醛均能引起顯著的EAG反應，其中乙二醇、苯甲醇、膽固醇、正癸醇、正庚醛、正丙醛和正壬醛均有吸引作用(Purietal., 2006)。通過這些研究，證實人體氣味物質通過蚊蟲的嗅覺系統影響蚊蟲的宿主搜尋行為。有些人體氣味物質，例如辛醇還被進一步開發成引誘劑，用于蚊蟲種群監測或防治(Bonvechio, 1991; Bernieretal., 1999, 2000; Smallegangeetal., 2010)。因此，深入研究宿主氣味物質與蚊蟲的互作關系有助于揭示蚊蟲追尋宿主的機制，開發新型蚊蟲引誘劑或驅避劑。

中華按蚊隸屬于雙翅目(Diptera)蚊科(Culicidae)，是中國廣大平原地區傳播瘧疾的重要媒介，也是中國和亞洲東南部其他國家傳播絲蟲病的媒介之一(Zmuanpuiietal., 2014)。對于中華按蚊嗅覺系統的研究，有助于減少蚊蟲與人類宿主的接觸，防止傳染病的傳播，也可為基于嗅覺的行為調控提供理論依據。在前期研究中，從中華按蚊基因組數據中共鑒定了64個氣味結合蛋白基因，分屬于Classic, Plus-C和Atypical 3個亞家族(Heetal., 2016)；從中華按蚊不同組織的轉錄組數據中發現，AsinOBP1,AsinOBP2,AsinOBP7,AsinOBP66等基因在雌蚊觸角中富集表達，通過CRISPR/Cas9技術突變AsinOBP1基因，蚊蟲對宿主的追尋能力下降，吸血受到影響(數據未發表)。這些前期的研究結果暗示這些在雌蚊觸角高表達的OBP基因可能在追尋宿主中起著重要的作用。本研究在前期研究基礎上，利用qPCR研究了AsinOBP2基因在中華按蚊不同發育時期、成蟲不同組織及吸血前后的表達水平，通過構建原核表達系統、Ni離子親和層析技術獲得了較高純度的重組蛋白，利用熒光競爭結合實驗測試了重組蛋白與39種人體氣味物質的結合特性，為進一步探究AsinOBP2在中華按蚊嗅覺系統和追尋宿主中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

實驗用中華按蚊種群飼養于重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所，自交保種已超過30代。幼蟲用魚飼料飼養于清水中，待其化蛹后挑出放于塑料小桶中等待羽化。成蚊用10%葡萄糖水飼養，羽化后第3天用麻醉的小鼠喂血，供繁殖傳代。蚊蟲飼養條件：溫度27±1℃，相對濕度75%±5%，光周期12L∶12D。

1.2 試劑

Trizol購自Ambion公司，反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司，3′RACE試劑盒3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends購自Invitrogen公司，2×Pro Taq Master Mix、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和DNA提取試劑盒購自康維世紀生物科技有限公司，SYBR Premix ExTaq、限制性核酸內切酶、DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，克隆試劑盒pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司，表達感受態Rosetta(DE3)菌株購自上海唯地生物科技有限公司，1-NPN熒光探針購自Sigma公司，氣味標樣購自Macklin公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

收集中華按蚊3日齡雌、雄成蟲觸角(各100頭，約200根觸角)、喙(各100根)和下顎須(各100頭，約200根下顎須)；收集中華按蚊雌雄蛹、剛羽化成蚊以及羽化后第1, 2, 3, 6和9天成蚊各3頭；收集取吸血前和吸血后12, 24和48 h的3日齡雌成蚊以及同時期未吸血雌成蚊(對照)各3頭。以上為各種樣品的一個生物學重復。參照RNA提取試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop ND-1000)檢測總RNA濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用DNase I除去總RNA中的基因組DNA后反轉錄合成cDNA第1鏈，-80℃保存備用。

1.4 AsinOBP2基因克隆和生物信息學分析

根據已鑒定的AsinOBP2基因序列(Heetal., 2016)，設計特異性引物用于AsinOBP2基因編碼序列的驗證和3′端非編碼序列的克隆，引物序列見表1。 以中華按蚊雌蟲觸角cDNA為模板擴增AsinOBP2基因編碼序列。PCR反應體系(25 μL): cDNA模板1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL, 去離子水9.5 μL。PCR反應程序: 95℃預變性5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環; 72℃延申5 min, 12℃保存。3′端非編碼序列的擴增參照RACE試劑盒說明書，進行兩輪巢式PCR，反應體系: 中華按蚊雌蟲觸角cDNA模板1 μL, 引物各1 μL, ExTaq酶12.5 μL, 去離子水9.5 μL，混勻離心后進行PCR擴增，首輪PCR產物稀釋20倍取1 μL作為第二輪PCR的模板。反應程序: 95℃預變性5 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環; 72℃延伸2 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將符合預期大小的DNA片段切膠回收，克隆后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

表1 本研究所用引物

用DNAMAN 4.0軟件拼接AsinOBP2基因的測序片段，組裝成為全長的cDNA序列。 用AsinOBP2基因cDNA序列在VectorBase進行在線比對(https:∥www.vectorbase.org/blast)，提取中華按蚊基因組序列，用GENSCAN預測基因，分析內含子、外顯子結構(https:∥genes.mit. edu/ GENSCAN.html)。用在線軟件(http:∥www.Expasy.org/compute_pi/)對蛋白質的分子量和等電點等基本物理形狀進行分析預測，蛋白質結構域采用SAMART軟件進行分析(http:∥ smart.embl-heidelberg.de/)，信號肽分析采用SignalP 5.0 Server軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。分別以AsinOBP2基因的核酸和蛋白質序列為詢問序列，在VectorBase搜索同源序列，使用MEGA4.0軟件中的鄰接(neighbor-joining, NJ)法構建系統發育樹，分支節點支持率采用1 000次重復抽樣進行氨基酸序列聚類分析。

1.5 AsinOBP2基因在中華按蚊不同發育時期、不同組織及吸血前后雌成蚊中的表達分析

以中華按蚊RibosomalproteinS7(Rps7)基因(Unigene23940_5，見中華按蚊轉錄組數據GBEO01000000)為內參基因，利用CFX-96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)檢測AsinOBP2基因的表達量，定量PCR引物見表1，反應體系(20 μL): SYBR Premix ExTaq 10 μL, cDNA模板 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, ddH2O 7.4 μL。反應程序: 95℃預變性3 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃30 s, 共40個循環；最后在60℃～95℃記錄熔解曲線。各時期個體或組織樣品以1.3節合成的cDNA作cDNA模板。每種樣品設3個生物學重復，每樣品重復測定3次。利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.6 AsinOBP2基因的原核表達與純化

以中華按蚊雌蟲觸角cDNA為模板，利用帶有酶切位點的特異性引物(表1)擴增AsinOBP2基因的全長編碼序列，將擴增產物純化回收后連接至克隆載體(pEASY?-Blunt Zero Cloning Vector)并轉化至感受態細胞，挑選陽性克隆，震蕩培養后提取質粒DNA測序驗證。 將AsinOBP2克隆載體和pET-28a(+)質粒DNA用限制性內切酶BamH I和HindⅢ在37℃酶切4 h，純化回收后在T4 DNA連接酶的作用下將目的片段連接到表達載體pET-28a(+)上。最后將重組表達質粒轉化到Rosetta(DE3)感受態細胞，涂板培養后，挑單菌落接種于LB培養液中過夜震蕩培養(37℃ 200 r/min)。將小量培養后的菌液按1∶100(v/v)接種至500 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃ 220 r/min震蕩培養至OD600=0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃誘導表達2.5～3 h，收集菌體后用超聲波進行破碎處理(500 W，45次，每次10 s，間隔10 s)，4℃ 12 000×g離心30 min后分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。參照Ni-Agarose His 標簽蛋白純化說明書進行親和層析純化蛋白，純化后的重組蛋白置于-80℃保存備用。

1.7 熒光競爭結合實驗

采用熒光競爭結合實驗測定AsinOBP2與39種人體氣味物質(表2)的結合能力。熒光競爭結合實驗使用HITACHI公司的F-2500型熒光分光光度計進行，所用容器為1 cm寬的石英杯，狹縫寬度為10 nm。將熒光探針1-NPN溶于甲醇，終濃度為1 mmol/L。在測定熒光探針與AsinOBP2的結合常數時，設定激發光波長為337 nm，掃描的發射光波長為390～500 nm。向石英杯中加入50 mmol/L的Tris Buffer(pH 7.4)，然后加入AsinOBP2蛋白，使其終濃度為2 μmol /L，充分混勻并靜置2 min后掃描并記錄發射光譜。隨后加入1-NPN溶液，使1-NPN終濃度依次從2～16 μmol /L，濃度梯度每次增加2 μmol /L。每組實驗重復3次，利用Scatchard方程計算AsinOBP2 /1-NPN的結合常數。測定氣味物質與AsinOBP2的結合常數時，首先配制氣味標樣，將各種氣味標樣溶于甲醇溶液，使其終濃度為1 mmol/L，放在4℃冰箱備用，然后在石英杯中加入50 mmol/L的Tris Buffer(pH 7.4)，然后加入熒光探針1-NPN及AsinOBP2蛋白，使其終濃度為2 μmol/L。隨后加入1 mmol/L的氣味物質，氣味物質終濃度為10, 20, 30, 40, 50, 60和70 μmol/L的梯度加入到熒光探針1-NPN與AsinOBP2蛋白混合溶液中，記錄最大的熒光強度值，每個樣品3次重復。假設蛋白活性為100%，在飽和情況下蛋白和配基結合的比例為1∶1，根據公式Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計算蛋白與氣味配體的解離常數Ki，其中IC50為氣味配體使熒光值降低到初始熒光值一半時的濃度(配基能替換50% 的1-NPN時的濃度)，[1-NPN]為未結合的1-NPN濃度，K1-NPN為AsinOBP2與1-NPN的解離常數。

1.8 數據分析

目的基因在成蟲不同部位和不同時期的表達量差異用單因素方差分析(Turkey氏檢驗)進行檢驗，在雌雄間及吸血與未吸血間的表達量差異用獨立樣本t檢驗(independent samplest-test)進行檢驗，以P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 AsinOBP2基因克隆與序列特征

AsinOBP2的編碼序列擴增和3′RACE擴增均得到一個單一的條帶。測序后進行序列拼接，獲得AsinOBP2基因全長的cDNA序列，其開放閱讀框長492 bp，編碼163個氨基酸，3′端非編碼區186 bp，預測等電點為5.18，分子量為18.8 kD。將AsinOBP2基因cDNA序列比回到基因組序列，得到AsinOBP2的基因結構(GenBank登錄號: MT700441)，包含2個外顯子和1個內含子，外顯子1長474 bp，外顯子2長204 bp，內含子長80 bp。利用SignalP 5.0 Server進行信號肽預測，N端疏水區包含由起始位置開始的30個氨基酸組成的信號肽，推測AsinOBP2為分泌型蛋白。序列比對分析發現AsinOBP2有一個保守的PhBP結構域(第59-156位氨基酸，E=4.77e-20)。

將AsinOBP2氨基酸序列與其他按蚊屬蚊蟲的OBP2進行多序列比對發現，AsinOBP2具有氣味結合蛋白的典型特征，含有6個高度保守的半胱氨酸殘基， 屬于Classic亞家族(圖1)。同源性分析顯示AsinOBP2與與岡比亞按蚊OBP2、黑小按蚊AnophelesatroparvusOBP2、白魔按蚊An.albimanusOBP2和致倦庫蚊OBP2的氨基酸序列一致性分別為70.2%, 63.6%, 59.7%和51.7%。系統進化樹顯示，AsinOBP2與白魔按蚊和黑小按蚊的OBP2聚類到獨立的Classic OBP進化枝(圖2)，表明它們在進化上關系更密切。

圖1 中華按蚊AsinOBP2與其他蚊蟲OBP2蛋白的氨基酸序列比對

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的中華按蚊AsinOBP2與其他昆蟲OBPs的系統發育樹(1 000次重復)

2.2 AsinOBP2的時空表達譜

qPCR結果顯示，AsinOBP2在雌、雄蛹中幾乎沒有表達；在雄成蟲中始終維持較低的表達水平，而在雌成蟲中的表達水平逐漸增強，羽化后第6天達到最高，隨后下降；在剛羽化和羽化后第1天的雌、雄成蟲之間表達差異不顯著(P>0.05)，羽化第2-6天在雌成蟲中的表達水平顯著高于在雄成蟲中的(P<0.05)(圖3: A)，羽化后第2, 3和6天雌蟲的表達量分別是雄成蟲的6.45, 3.49和6.61倍。AsinOBP2主要在3日齡成蟲觸角中表達，在雌、雄成蟲觸角中的表達水平均顯著高于在下顎須和喙中的(P<0.05)(圖3: B)；AsinOBP2在雌成蟲觸角中的表達量分別是在喙和下顎須中的43.1倍和155.1倍，在雄成蟲觸角中的表達量分別是在喙和下顎須中的4.1和142倍。AsinOBP2在吸血后的表達水平顯著下調(圖4)，吸血后12, 24和48 h時對照組的表達量分別是吸血組的4.67, 7.53和65倍。

2.3 AsinOBP2的原核表達與純化

將成功構建的原核表達載體pET-28a(+)/AsinOBP2轉入宿主菌Rosetta(DE3)，經IPTG誘導表達出目的蛋白。SDS-PAGE電泳結果顯示目的蛋白主要以包涵體形式表達(圖5: A)，通過變性，純化，透析復性后在21 kD左右處出現預期的單一條帶(圖5: B)。

2.4 AsinOBP2重組蛋白與人氣味配體的結合能力

圖3 AsinOBP2在中華按蚊不同發育時期(A)及3日齡成蟲不同嗅覺組織中(B)的相對表達量

圖4 AsinOBP2在中華按蚊羽化后3 d雌成蟲吸血前后的相對表達量

圖5 AsinOBP2的表達(A)和純化(B)的SDS-PAGE分析

重組蛋白AsinOBP2在337 nm激發光波長下自身無明顯的內源熒光信號。向AsinOBP2重組蛋白中以2 μmol/L的濃度梯度加入1-NPN溶液，在410 nm進行掃描，熒光強度的增幅隨加入1-NPN的濃度增加而逐漸增強，最終蛋白和1-NPN的結合達到飽和，通過Scachard方程對AsinOBP2與1-NPN的結合曲線進行線性化，計算出該蛋白與1-NPN的解離常數為8.310 μmol /L(圖6)。AsinOBP2與人體氣味物質的熒光競爭結合實驗結果顯示，在測定的39種氣味物質中，僅有12種能將熒光探針1-NPN從重組AsinOBP2蛋白溶液中替換50%以上，說明AsinOBP2的氣味結合譜較窄，具有選擇性識別人體氣味物質的特性(圖7)。AsinOBP2與部分醛、醇、酸和雜環族化合物有結合活性，與吲哚結合能力最強，解離常數Ki=27.15 μmol/L；與正丙胺、2-甲基丁醛、葵醛具有一定結合能力，其解離常數Ki分別為42.49, 48.33和47.90 μmol /L；與3-甲基吲哚、己醛、正庚醛、正戊醛、正癸酸、對二甲苯、乙基苯和反式-2-己烯醇結合能力較弱(Ki>50 μmol /L)，與其他28種氣味分子不能結合(表2)。

圖6 AsinOBP2重組蛋白與1-NPN的結合曲線及斯卡查德方程

3 討論

本研究qPCR分析發現，AsinOBP2在雌成蟲觸角中高表達(圖3: B)，與嗅覺組織的轉錄組分析結果一致(數據未提供)；不同發育時期的定量分析顯示，AsinOBP2在雌成蟲中的表達水平顯著高于雄成蟲的，而且在羽化后呈上升表達趨勢，在雄成蟲中則始終維持在較低的表達水平(圖3: A)。 與AsinOBP2直系同源的岡比亞按蚊OBP2基因(AgamOBP2)在雌成成蟲中的表達水平高于雄成蟲，主要在雌成蟲頭部高表達(Marinottietal., 2006)；雌成蟲AgamOBP2的表達水平在羽化后呈現上升趨勢， 而在雄成蟲中則維持穩定的低水平表達(Cook and Sinkins 2010)，與AsinOBP2的表達模式一致。觸角是昆蟲最重要的嗅覺器官，AsinOBP2在雌成蟲的觸角中高表達，推測其與雌成蟲的特異性行為有關，比如追尋宿主、吸血和尋找產卵場所等。AsinOBP2基因的表達水平在雌成蟲吸血后顯著下降(圖4)，與AsinOBP2基因直系同源的岡比亞按蚊AgamOBP2和致倦庫蚊CquiOBP2在吸血后表達水平均顯著下降 (Pintoetal., 2009; Tapariaetal., 2017)，與蚊蟲吸血后進入靜息狀態的行為相契合，說明AsinOBP2基因可能與追尋宿主有關。

圖7 人體氣味物質分子和1-NPN與重組蛋白AsinOBP2的競爭結合

表2 重組蛋白AsinOBP2與人體氣味物質的結合能力

為了進一步驗證AsinOBP2基因的功能，對其進行了原核表達和與人體氣味物質的結合特性分析。蚊蟲通過嗅覺感知人體揮發物，進而逆向追蹤。Bernier等(2000)采用GC/MS對人體皮膚揮發物進行分析，檢測到了346個峰，鑒定出277種化合物。采用單感記錄儀測定其中103種氣味物質引起埃及伊蚊的電生理反應，結果顯示89種物質能夠引起明顯的刺激或抑制反應(Chenetal., 2019)。根據Chen等(2019)的結果，選取了反應較強的39種人體氣味物質，通過熒光競爭結合實驗測定了AsinOBP2與這些物質的結合能力，結果顯示12種氣味物質能夠將AsinOBP2/1-NPN復合體中的1-NPN競爭至50%以下(表2)。在12種結合的物質中，與吲哚的結合能力最強(Ki=27.15 μmol/L)，與其余物質的結合能力較弱(Ki>40 μmol/L)，說明AsinOBP2能夠選擇性地結合人體揮發物中的一些組分，在中華按蚊追尋宿主的過程中起著作用。本研究中人體氣味物質的選擇是依據埃及伊蚊電生理的結果，有可能導致與AsinOBP2親和力更強的氣味物質被人為地遺漏。因此，吲哚是不是人體揮發物中與AsinOBP2親和力最強的天然配體，還有待進一步研究。擴大人體氣味物質篩選的數量，將有可能篩選到與AsinOBP2親和力更強的人體氣體物質。

吲哚屬于芳香族雜環有機化合物，人體表某些種類的細菌能夠分解色氨酸產生吲哚，是人體揮發物中的主要組分(Elgaalietal., 2002)，甚至可以占到汗液揮發物的30%以上。除AsinOBP2外，中華按蚊AsinOBP1(未發表數據)和岡比亞按蚊AgamOBP1也能結合吲哚(Biessmannetal., 2010; Dimitratosetal., 2019)，說明吲哚可與多種氣味結合蛋白結合。吲哚能引起岡比亞按蚊雌成蚊觸角毛狀感器的強烈電生理反應(Blackwell and Johnson 2000; Meijerinketal., 2000; Qiuetal., 2006b)，并可以激活埃及伊蚊(Sijuetal., 2010)、致倦庫蚊(Hilletal., 2009; Syed and Leal, 2009)和環跗庫蚊Culextarsalis(Du and Millar, 1999)的嗅覺受體神經元。用RNAi方法抑制AgamOBP1基因的表達，岡比亞按蚊對吲哚的觸角電位反應明顯減弱(Biessmannetal., 2010)；抑制致倦庫蚊CquiOBP1表達，對吲哚的觸角電位反應也顯著減弱(Pelletieretal., 2010)。由此可見，蚊蟲能夠通過嗅覺系統感知人體揮發物中的吲哚，進而感知宿主；AsinOBP2基因可能是通過識別人體揮發物中的吲哚等氣味物質，感知和追尋宿主。

致倦庫蚊CquiOBP2蛋白的結合特性研究發現，CquiOBP2能結合3-甲基吲哚(skatole)，不能結合吲哚(Yinetal., 2015)。AsinOBP2與CquiOBP2為直系同源基因，氨基酸序列一致性為51.7%，但AsinOBP2的結合特性與CquiOBP2相反，能夠結合吲哚，而與3-甲基吲哚結合能力很弱(表2)。通過同源建模、分子對接和定點突變等方法比較研究這兩個蛋白的結合特性和結構差異，將有助于揭示AsinOBP2結合配體的機制。除此之外，吲哚和3-甲基吲哚既是人體揮發物的主要組分，又是岡比亞按蚊和致倦庫蚊典型的產卵刺激劑(Millaretal., 1992; Blackwell and Johnson, 2000)。AsinOBP2能夠結合吲哚，是否說明AsinOBP2與雌蚊尋找產卵場所有關，還有待進一步研究。

本研究通過表達分析證實AsinOBP2在中華按蚊雌成蟲觸角中富集表達，在羽化后的雌成蟲中表達水平逐漸增強，吸食血液后表達水平顯著下降，而且AsinOBP2能夠結合吲哚等人體氣味物質，說明AsinOBP2在中華按蚊的嗅覺系統中起著重要的作用，可能與雌成蟲追尋宿主有關。還需要通過RNAi或基因編輯、電生理、行為學和結構生物學等方法進一步研究該基因的功能，為基于AsinOBP2蛋白篩選引誘或驅避劑、或進行行為調控以減少蚊蟲與人類接觸的機會奠定基礎。