RNAi抑制小菜蛾Br-Z2/3基因對下游細胞凋亡基因表達及化蛹的影響

胡曉漢, 田素芬, 李亞勍, 林 碩, 陳藝欣, 魏 輝,顧曉軍,2,*, 黃勁飛,2,*, 王曦瑩, 李志華

(1. 福建農林大學植物保護學院, 福州350002; 2. 福建省農業科學研究院, 福建省作物有害生物監測與治理重點實驗室,福州350003; 3. 福建省農業科學研究院, 農業農村部福州作物有害生物科學觀測試驗站, 福州 350013)

小菜蛾Plutellaxylostella屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，在全世界140多個國家以及中國各地區普遍發生，幼蟲取食十字花科作物，寄主包括甘藍、芥藍、花菜、白菜、蘿卜、油菜等重要經濟作物(https:∥www.cabi.org/isc/datasheet/42318; Zhuetal., 2011; 柯富士等, 2019)。據統計，由該蟲所造成的損害及其控制成本每年全球累計達40～50億美元(Furlongetal., 2013)，中國達7.7億美元(Lietal., 2016)。長期以來小菜蛾的防治主要依靠各類農藥(包括化學農藥和生物農藥)的使用，但小菜蛾幾乎對各種農藥都能在短時間內迅速產生高水平抗性，而農藥使用后產生的農藥殘留也可能污染環境和損害人體健康。可見，小菜蛾防治急需新的防治思路。

參與昆蟲蛻皮、變態、生殖等重要生理過程及響應病原侵染、農藥等不良因子脅迫的相關基因的表達均受轉錄因子的調控(Guoetal., 2018; Heetal., 2020; Palli, 2020； 趙國棟等, 2020)，因而轉錄因子在害蟲控制及新農藥開發中具有良好的應用前景(Guoetal., 2018; Zhaoetal., 2018)。在眾多轉錄因子中，全變態昆蟲蛹期蛻皮激素的初級響應基因Br在害蟲控制中的應用價值則尤為值得關注。其對化蛹的調控機制是全變態昆蟲末齡幼蟲體內保幼激素消失、蛻皮激素引發Br大量表達，進而結合下游靶基因如caspase家族基因Dronc及reaper,hid和Drice等細胞凋亡關鍵基因的啟動子區域，啟動化蛹進程(Jiangetal., 2000; Lee and Baehrecke, 2001; Cakourosetal., 2002; Leeetal., 2002; Kilpatricketal., 2005)。

在小菜蛾中，目前發現了Br-Z2/3及Br-Z7兩種Br異構體，其中Br-Z2/3在預蛹期表達水平最高(超過表達最低成蟲階段的300倍以上)，其次是在4齡幼蟲末期(水平超過成蟲的100倍)，與小菜蛾化蛹關系更為密切(Huangetal., 2019)。通過dsRNA飼喂法處理小菜蛾4齡幼蟲后，雖然靶標基因Br-Z2/3表達降低了40%，但是也有近40%的試蟲成功化蛹(Huangetal., 2019)，說明RNAi效率不高。本研究一方面擬采用dsRNA顯微注射法實施RNAi，以期提高RNAi效果；另一方面擬采用原核表達法合成dsRNA，代替先前的試劑盒體外合成，以期提高dsRNA合成效率。應用大腸桿菌EscherichiacoliHT115表達獲得dsRNA具有合成時間短、合成量大、成本低的優點，已在多種鞘翅目、直翅目昆蟲中成功應用過(Ratzkaetal., 2013)。其原理是將L4440 載體(含有雙向 T7 啟動子和 lac乳糖操縱子)轉化入大腸桿菌HT115。由于大腸桿菌HT115是RNase Ⅲ缺陷型菌株，故誘導該菌表達的目的基因 dsRNA不會被RNase Ⅲ酶切降解(Newmarketal., 2003)。基于此，本研究采用原核表達系統大量合成Br-Z2/3 dsRNA，注射法處理小菜蛾4齡幼蟲后考察試蟲Br-Z2/3與細胞凋亡基因reaper,caspase-9和Gadd45g表達及其化蛹變化，以期進一步闡明Br-Z2/3對小菜蛾化蛹的調控機理及其在小菜蛾防治中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為本實驗室長期室內飼養的小菜蛾敏感種群，幼蟲寄主植物為蘿卜苗。具體飼養方法條件：將蘿卜種子浸泡過夜后，再用75%百菌清可濕性粉劑(或50%多菌靈可濕性粉劑)的500倍稀釋液浸泡40 min消毒，沖洗濾干，然后將經高溫濕熱滅菌處理的營養土平鋪在長方形不銹鋼托盤(40 cm×20 cm)內(厚3～3.5 cm)，充分澆水后均勻撒播蘿卜種子，待蘿卜苗長至約6 cm高時，飼喂小菜蛾幼蟲(韓藝欣等, 2019)。集中收集蛹置于養蟲籠(長×寬×高=25 cm×25 cm×30 cm)中，成蟲羽化后以10%(w/v)蜜糖水補充營養，剪取鮮嫩蘿卜苗(6 cm)，將蘿卜苗榨汁后，均勻涂于鋁箔錫紙(10 cm×10 cm)(購自鄭州鴻富源工貿有限公司)供成蟲產卵，飼養溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16 L∶8D。

1.2 小菜蛾總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

由于Br-Z2/3基因在預蛹期高表達(Huangetal., 2019)，故于小菜蛾的預蛹期取樣(陳藝欣等, 2011)，-80℃保存備用。參考天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，參考全式金生物技術有限公司的反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈，-20℃保存備用。

1.3 dsRNA表達載體的構建

根據本課題組前期研究已經上傳NCBI的小菜蛾Br-Z2/3基因序列(GenBank登錄號: MG753773.1)，并以pIZT/v5-his載體中GFP序列為陰性對照，利用Primer 5.0軟件設計一對擴增Br-Z2/3基因干擾片段和GFP的引物。分別在Br-Z2/3正反向引物的5′端加上SacⅠ和KpnⅠ酶切位點，以及在GFP正反向引物的5′端加上SacⅠ和SalⅠ酶切位點。引物由福州尚亞生物技術有限公司合成，序列詳見表1。

表1 本研究所用引物

分別以1.2節合成的預蛹期小菜蛾cDNA和pIZT/v5-his質粒為模板，使用采購自南京諾唯贊公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase擴增Br-Z2/3基因RNA干擾片段及GFPRNA干擾對照片段。PCR反應程序: 95℃預變性3 min; 95℃ 15 s, 59℃ 15 s, 72℃ 30 s, 35個循環; 72℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并利用凝膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)回收并純化上述PCR產物后，連接pEASY-Blunt Cloning載體，將陽性克隆菌液送至福州尚亞生物技術有限公司測序。

使用內切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切pEASY-Blunt-Br-Z2/3質粒和L4440空載體，并使用內切酶SacⅠ和SalⅠ雙酶切 pEASY-Blunt-GFP質粒及L4440空載體(酶切時間均為3 h)，凝膠回收后，將目的片段和L4440載體線性化片段在16℃環境中用T4連接酶過夜連接。連接產物再轉化至大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，涂板對應抗性LB固體培養基培養過夜，挑取陽性單克隆菌落擴大培養，進行酶切驗證。

1.4 dsRNA表達載體的誘導表達

將1.3節構建成功的含小菜蛾Br-Z2/3基因以及GFP基因片段的dsRNA表達載體 L4440-Br-Z2/3和L4440-GFP轉化至大腸桿菌HT115感受態中，涂板對應抗性平板培養過夜，挑取陽性單克隆后用T7引物擴增檢測轉化是否成功。挑取含有dsRNA表達載體的單菌落接種于20 mL LB液體培養基(含50 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL四環素20 μL)，37℃ 200 r/min振蕩培養至菌液OD600=0.4～0.6，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導，再繼續培養4 h，誘導dsRNA表達載體表達，收集菌液，采用細胞總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取RNA，-80℃保存備用。

1.5 顯微注射法介導RNA干擾

根據小菜蛾4齡幼蟲體型特征(陳藝欣等, 2011)，挑取生長日齡相同、體型一致的4齡第2天小菜蛾幼蟲80頭隨機放入8個直徑5 cm底部墊有濕潤濾紙的塑料培養皿中，每皿10頭。 在溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期16L∶8D條件下，用新鮮蘿卜苗飼喂12 h。處理組、對照組各4個培養皿小菜蛾4齡幼蟲分別注射100 nLBr-Z2/3 dsRNA(處理組)和100 nLGFPdsRNA(陰性對照)，dsRNA濃度約為1 000 ng/μL，采用Nanoject Ⅲ顯微注射器(購自武漢蓋爾德納科技有限公司，型號3-000-207)，注射部位為小菜蛾4齡第2天幼蟲第3腹節背板，每頭試蟲注射1次。以上實驗進行3次生物學重復。

1.6 RNAi后Br-Z2/3, caspase-9, reaper和Gadd45g的表達水平測定

1.5節RNAi處理組和陰性對照組于12和24 h后隨機選取5頭幼蟲，利用總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取供試小菜蛾總RNA，利用全式金生物技術有限公司反轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈。 根據NCBI中已登錄的Br-Z2/3及其下游細胞凋亡基因caspase-9(GenBank登錄號: KF030680.1),reaper(GenBank登錄號: KF991219.1)和Gadd45g(GenBank登錄號: MW160738)的核酸序列，用軟件Primer5.0設計其qPCR引物，內參基因EF-1α(GenBank登錄號: EF417849)定量引物參考符偉等(2012)(表1)。qPCR反應體系參照NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus (近岸蛋白質科技有限公司)的說明書。反應程序: 94℃ 2 min; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個循環。每個處理或對照測定3個樣品，每個樣品3次技術重復。

1.7 RNAi后小菜蛾生物學指標觀測

RNAi處理后，每6 h觀察記錄試蟲死亡數、化蛹數、畸形蛹數，計算幼蟲死亡率、化蛹率、平均化蛹時間、蛹畸形率等。死亡率=(死亡蟲數/總試蟲數)×100%;化蛹率=(化蛹數/試蟲總數)×100%;畸形蛹率=(畸形蛹數/總化蛹數)×100%。

1.8 數據分析

基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)，獨立樣本T檢驗法檢驗處理與對照差異顯著性，顯著水平設定為P<0.05，運用SPSS 22.0完成。

2 結果

2.1 dsRNA表達載體的誘導表達

PCR擴增獲得小菜蛾Br-Z2/3(圖1: A)和GFP片段(圖1: B)。將克隆的片段與克隆載體pEASY-Blunt連接轉化，對pEASY-Blunt-Br-Z2/3及 pEASY-Blunt-GFP菌液PCR檢測的結果也表明分別與預期片段基本相符(圖1: C, D)，其測序結果與預期一致。

L4440-Br-Z2/3菌液PCR檢測得到一條大小接近500 bp的條帶(圖1: E)，L4440-GFP菌液PCR檢測得到一條大小接近350 bp的條帶(圖1: F)，與預期相符；L4440-Br-Z2/3重組質粒經雙酶切后得到一條約2 700 bp和一條約500 bp的條帶(圖1: G)。L4440-GFP重組質粒經雙酶切后得到一條約2 700 bp和一條約350 bp的條帶(圖1: H)，其結果與目的片段及線性L4440質粒片段大小一致，表明Br-Z2/3與GFP的dsRNA片段已構建至L4440載體上。測序結果也證實構建正確。

加入IPTG(1 mmol/L)后，于37℃誘導6 h，提取對照菌體總 RNA結果顯示如圖2。 L4440-Br-Z2/3菌株和L4440-GFP菌液均表達出與預期大小一致的dsRNA(箭頭所示)，而未經 IPTG 誘導的 L4440-Br-Z2/3 菌液與L4440-GFP菌液均未表達出相應dsRNA，純化后dsRNA濃度能夠高達1 040 ng/μL。

圖1 RNAi載體的構建

圖2 dsBr-Z2/3 (A)和dsGFP (B)在細菌中表達的鑒定

圖3 顯微注射Br-Z2/3 dsRNA后小菜蛾4齡幼蟲中Br-Z2/3, reaper, caspase-9和Gadd45g的表達量

2.2 Br-Z2/3基因RNAi后相關基因表達變化

qPCR檢測結果顯示，與陰性對照組比較，注射Br-Z2/3 dsRNA后12和24 h，Br-Z2/3相對表達量分別顯著下降了66.75%和83.47%(圖3: A)(P<0.05)；reaper相對表達量在12和24 h分別顯著下降了17.52%和82.71%(圖3: B)(P<0.05)；caspase-9相對表達量在12和24 h分別顯著上升了40.35%和34.76%(圖3: C)(P<0.05)；Gadd45g相對表達量在12和24 h分別顯著上升了321.77%和362.99%(圖3: D)(P<0.01)。

2.3 Br-Z2/3基因RNAi對小菜蛾化蛹的影響

注射Br-Z2/3 dsRNA后，處理組中試蟲便開始發生死亡，直至48 h幼蟲死亡率才穩定在40%，而對照中死亡率較低，30 h便穩定在6.67%(圖4: C)；處理組中即便是存活個體也沒有全部化蛹，實驗結束時，處理組中化蛹率為46.67%(圖4: B)，試蟲存活率低于60%(圖4: C)，而對照組中試蟲化蛹率為93.33%(圖4: B)，存活試蟲全部化蛹(圖4: C)；實驗組中試蟲化蛹也推遲，平均化蛹時間為50.13 h，顯著長于對照組的34.64 h(P<0.05)(圖4: A)；處理組成功化蛹的個體中還有相當數量的畸形蛹，畸形率達到56.67%(圖4: D)，而對照組中蛹畸形率僅有6.67%(P<0.05)(圖4: D)；畸形主要表現為預蛹不能成功蛻皮及個體偏小(圖5)。

3 討論

圖4 顯微注射Br-Z2/3 dsRNA到小菜蛾4齡幼蟲后對小菜蛾平均化蛹時間(A)、化蛹率(B)、幼蟲死亡率(C)和畸形蛹率(D)的影響

圖5 小菜蛾4齡幼蟲Br-Z2/3基因RNAi后畸形蛹

通過dsRNA沉默靶基因的表達是基因功能研究的重要方法。當前用于昆蟲學研究中dsRNA合成主要有試劑盒體外轉錄以及原核表達兩種。其中，dsRNA合成試劑盒價格較高，且合成 dsRNA 產出少、濃度低，而利用原核菌體表達的方法可低成本大量合成dsRNA(王雪慶等, 2018)。本研究中成功實現了Br-Z2/3 dsRNA的體外原核表達(圖2)，dsRNA濃度能夠高達1 040 ng/μL，較好滿足了實驗要求。而在dsRNA的遞送方面，通常有飼喂法和注射法兩種，對于體型較大個體一般都采用注射法。Huang等(2019)應用飼喂法研究Br-Z2/3 RNAi后試蟲化蛹變化，發現連續飼喂dsRNA 72 h后，試蟲Br-Z2/3基因的表達量也僅降低了40%，最終試蟲化蛹率仍可達36%。而本研究采用顯微注釋法注射Br-Z2/3 dsRNA 12 h后，試蟲Br-Z2/3的表達量便下降了66.75%，24 h更進一步降低了83.74%(圖3: A, B)，可見相較于飼喂法，顯微注射法見效更快、效果更好。

通常昆蟲Br基因沉默與保幼激素類似物處理能表現相同的癥狀(Spokony and Restifo, 2007)。對小菜蛾而言，保幼激素類似物蚊蠅醚處理小菜蛾3齡末幼蟲后，試蟲死亡率升高、化蛹推遲、化蛹率下降(Duanetal., 2016)。本研究中Br-Z2/3 dsRNA顯微注射法處理小菜蛾4齡幼蟲，結果也都類似(圖4)。此外，在赤擬谷盜Triboliumcastaneum研究中也發現，敲除其Br-Z1-Z4中任何一個異構體，導致試蟲死亡增加的同時，也有畸形蛹的出現(Konopova and Jindra, 2008)。本研究中也發現顯微注射Br-Z2/3 dsRNA后，部分試蟲雖未死亡但是所化蛹卻為畸形蛹(圖5)。

雖然改用顯微注射法后，RNAi效率顯著提高，靶基因表達降低了83.74%，但是試蟲最終化蛹率仍有近40%。其中可能有沉默效果仍不夠徹底的原因，也可能與小菜蛾中另一個Br基因Br-Z7的存在有關。Br蛋白對全變態昆蟲化蛹的啟動機制是Br促進細胞凋亡因子基因reaper,hid,dronc和drice等的表達從而誘導幼蟲相關組織的程序化死亡以及成蟲盤的分化(Jiangetal., 2000; Cakourosetal., 2002; Riddifordetal., 2003)。因而當Br基因表達受到抑制，其下游細胞凋亡基因表達也會相應下降，這便是試蟲reaper表達水平降低的原因(圖3: B)。然而作為dronc同源基因的caspase-9及Gadd45g表達卻顯著增加(圖3: C, D)，其中原因尚待進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建Br-Z2/3 dsRNA原核表達系統，并利用該系統合成的dsRNA通過顯微注射遞送小菜蛾4齡幼蟲而成功抑制Br-Z2/3基因的表達。此外，本研究發現成功干擾Br-Z2/3后，小菜蛾幼蟲死亡率顯著上升，化蛹高峰期推遲并出現畸形蛹；而與Br-Z2/3基因相關聯的reaper,caspase-9和Gadd45g的表達量也發生了顯著變化(P<0.05)，說明Br-Z2/3基因作為蛹期特異表達因子能夠顯著影響小菜蛾的蛹期進程。