昆蟲miRNA研究進展

楊 婕, 謝 苗, 徐雪嬌, 白建林, 尤民生,*

(1. 福建農林大學, 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室, 福州350002; 2. 福建農林大學應用生態研究所, 福州350002;3. 福建農林大學, 教育部害蟲生態防控國際合作聯合實驗室, 福州350002; 4. 福建農林大學生命科學學院, 福州350002)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類內源性的長度約為19～24 nt的單鏈非編碼小RNA，廣泛分布于動物、植物以及微生物體內，在基因的轉錄后調控(post-transcriptional regulation)中起著至關重要的作用，參與調控胚胎發育、細胞分化、增殖、神經發生、能量代謝、細胞凋亡以及晝夜節律等多種生物進程(Legeaietal., 2010)。據估計，動物中約有50%以上編碼蛋白的基因的表達都受到miRNA的調控(Kroletal., 2010)。

Lee等(1993)在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans幼蟲中發現了第一個由lin-4基因編碼產生的短鏈RNA，該短鏈RNA與lin-14基因3′UTR區存在的多個重復序列反向互補，因而能夠通過負鏈RNA-RNA互作時序性抑制lin-14基因的蛋白合成。Reinhart等(2000)在秀麗隱桿線蟲中發現了另一種具有時序調節功能的基因，將其命名為let-7。這類參與時序調節的RNA片段一般長度較短，且參與調控細胞發育進程，也被稱作小時序RNA(small temporal RNA, stRNA)，stRNA的發現掀起了對非編碼小RNA的鑒定以及對其生物學功能進行研究的熱潮。2001年，美國和德國的3個實驗室同時在《Science》報道了幾十個來自秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster以及人類Homosapiens的小RNA，由于這些基因具有相似的加工過程、結構、生理功能以及作用機制，科學家將這一類RNA統一命名為microRNA(miRNA)，這也是對昆蟲miRNA最早的報道。

繼miRNA被發現后，其在昆蟲中的研究工作逐漸開始發展，在Web of Science上以“microRNA insect”或“miRNA insect”為關鍵詞進行搜索，可以發現在21世紀相關報道逐漸增多，迄今為止已超過1 200篇，內容涉及miRNA及其靶標的鑒定、昆蟲抗藥性、抗病毒機制、免疫機制、昆蟲行為和其生長發育等多個方面，相關引文數量也不斷增加。隨著miRNA相關研究的不斷深入，其鑒定方法和技術也得到了大幅改進，研究人員相繼在許多物種中鑒定得到了大量已知和新的miRNA，為后續miRNA的相關研究建立了堅實的工作基礎。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成過程較為復雜，動物中成熟miRNA的合成過程主要包括4個步驟：轉錄、細胞核內加工、細胞核輸出以及細胞質加工。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II)的催化作用下，轉錄生成長度可達1 kb以上的雙鏈miRNA前體，即miRNA初始轉錄物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA可自發形成發夾結構(Cullen, 2004; Leeetal., 2004)。隨后，Pri-miRNA在細胞核內被RNase Ⅲ家族的雙鏈RNA結合蛋白Pasha(哺乳動物和線蟲中稱為DGCR8)特異識別，并被其與Drosha內切酶所形成的復合物剪切成為長度約為70～100 nt的miRNA前體(Pre-miRNA)，同時在其3′末端產生2個未配對的核苷酸。核內轉運蛋白Exportin-5可以特異識別并緊密結合Pre-miRNA 3′端突出的2個未配對核苷酸，將其從細胞核運送至細胞質中。Pre-miRNA在細胞質中被釋放出來并進一步被Dicer酶剪切成為miRNA-miRNA*雙鏈分子(Kettingetal., 2001; Knight and Bass, 2011)，即未成熟的miRNA(imperfect miRNA)。miRNA-miRNA*雙鏈分子再與以Argonaute 1(AGO1)為核心的蛋白質復合體相結合，雙鏈分子打開成為兩條單鏈的miRNA，其中一條鏈即為成熟的miRNA，稱為向導鏈(guide strand)，向導鏈參與形成miRNA誘導的沉默復合物(miRNA-induced silencing complex, miRISC)，遵循堿基互補配對原則與靶基因結合，調控基因表達(Bartel, 2004)，另一條miRNA*即為隨從鏈(passenger strand)(圖1: A)。由于沒有相應蛋白質的保護，miRNA*容易被迅速降解，因而其豐度遠低于miRNA(Lagos-QuiIltanaetal., 2002)。但是目前隨著miRNA相關研究的不斷深入，有一些證據表明，miRNA*也可與AGO蛋白結合從而調控相關基因的表達(F?rstemannetal., 2007; Tomarietal., 2007; Okamuraetal., 2009)，也可能會轉變成為新的miRNA或有功能的miRNA產物(Okamuraetal., 2008)。

1.2 miRNA的作用方式

目前，對小鼠Musmusculus、秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅和擬南芥Arabidopsisthaliana等模式生物中的miRNA及其調控機制的研究工作已取得一定進展(Babiarzetal., 2008; Enderetal., 2008; Ravasietal., 2010)。

成熟miRNA的5′端第2-8位核苷酸被稱為miRNA的“種子序列(seed sequence)”，通常能與靶基因mRNA的3′UTR區以堿基互補配對原則進行結合從而調控基因表達(Leeetal., 1993; Wightmanetal., 1993)。除此之外，miRNA也可以作用于靶基因ORF以及5′UTR(Orometal., 2008)。已有研究表明，超半數的AGO蛋白與miRNA的結合位點位于ORF區內(Chietal., 2009; Greyetal., 2010; Hafneretal., 2010)。在ORF區和3′UTR區均含有靶位點的基因的mRNA和蛋白的表達水平略低于僅在3′UTR有靶標位點的基因，同時其表達也會受到更多調控(Fang and Rajewsky, 2011)。miRNA一般通過兩種機制負向調控靶基因的表達：在植物中，miRNA通過與靶基因完全互補導致靶基因mRNA被切割或翻譯抑制；在動物中，miRNA則通過與靶基因不完全互補抑制靶基因的翻譯，即翻譯起始后抑制蛋白形成。例如果蠅中某些miRNA的結合位點位于ORF區和5′UTR區，miR-2通過cap-dependent的方式抑制靶標mRNA翻譯起始，并且在ORF和5′UTR的結合位點誘導其去腺苷酸化，進而調控基因表達，影響胚胎發育過程中的細胞凋亡(Ronaldetal., 2003; Leamanetal., 2005)。

miRNA和靶基因的關系并不是一一對應的，而是“多對多”的關系，即一個miRNA可以調控多個靶基因的表達，一個靶基因也可能受到多個miRNA的共同調控(圖1: B)。各種miRNA和靶基因構成了一個龐大的基因調控網絡，而這種機制的存在也使得miRNA調控基因表達的過程十分復雜(Brodersen and Voinnet, 2009; Shinetal., 2010)。

1.3 miRNA的研究方法

圖1 miRNA生物合成過程(A)及miRNA介導的基因調控機制(B)

1.3.1miRNA及其靶標基因的鑒定：miRNA的鑒定主要有3種方法：直接克隆法、生物信息學預測以及高通量測序法。其中生物信息學預測目前應用范圍較廣，利用miRNA前體具有典型的莖環結構和miRNA結構的熱力學穩定性等固有特征，利用相關軟件對miRNA進行預測(Mendesetal., 2009)。高通量測序可直接從分子水平對細胞或組織中的miRNA進行深度測序并對結果進行分析，無需參考基因組序列，由于其具有靈敏度高、測序通量大且成本較低等優點，被廣泛應用于各個物種中(Schreiberetal., 2011)。第二代測序技術主要包括：Roche/454焦磷酸測序、Illumina/Solexa聚合酶合成測序及ABI/SOLID連接酶測序，由于這3種二代測序技術的原理各不相同，其數據產出量、數據質量和單次運行成本也不同。其中Roche/454測序技術序列讀長(reads)較長(600～1 000 bp)，但通量較低；Illumina/Solexa測序技術reads較短(約100 bp)但測序通量大，適合進行miRNA測序(RNA-seq)，此外，該測序技術產生的原始數據格式可以應用于多種miRNA分析軟件，不僅可以對sRNA的基因組信息進行注釋，還可以進行表達水平分析和靶基因預測等；而ABI/SOLID讀長最短，只有50 bp，且應用了雙堿基編碼，有效降低了測序的錯誤率，尤其適用于具有高質量參考基因組的物種的重測序(Luoetal., 2012)。

相較于植物miRNA與其靶標基因的高度互補，在動物中，miRNA與其靶標基因常形成不完全互補的功能雙鏈，結合區域常會出現gaps和堿基錯配(Brenneckeetal., 2005)，這為動物miRNA靶標基因的鑒定帶來較大的不確定性。目前常用的miRNA靶標基因預測軟件雖算法不盡相同，但都遵循以下幾個原則：(1) miRNA與靶位點在種子區域互補；(2) miRNA靶位點在不同物種間較為保守；(3) miRNA與靶mRNA雙鏈間熱力學穩定性較高且miRNA靶位點處不存在復雜二級結構；(4) miRNA 5′端的結合能力較3′端強。目前幾種常見的靶標基因預測軟件主要包括：miRanda(http:∥www.miranda.org/), RNAhybrid(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/), TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和PicTar(https:∥pictar.mdc-berlin.de/)等。miRanda作為最早的miRNA靶標基因預測軟件，主要以序列匹配度、miRNA-mRNA雙鏈熱穩定性和靶標位點保守性為篩選依據，允許G=U錯配，同時強調miRNA第2-4位堿基與靶標基因的精確匹配(Quilletetal., 2019)。RNAhybrid是經典的RNA二級結構預測軟件的擴展，通過分析短鏈RNA和長鏈RNA雜交的最小自由能尋找miRNA的最佳靶位點，該算法不考慮靶標基因在物種間的保守性(Rehmsmeieretal., 2004)。TargetScan要求miRNA的種子區域和靶標基因ORF或者3′UTR區完全互補，以此對miRNA生物靶點進行預測，預測假陽性率較低(Agarwaletal., 2015)。PicTar強調miRNA種子區域在靶位點識別以及轉錄后調控的關鍵作用，把種子區域分為“完全匹配”和“不完全匹配”，并對兩類種子序列對應的miRNA和靶標基因二聚體間的結合能進行限制，有效降低預測假陽性(Xuetal., 2014)。由于各個預測軟件算法不同，預測結果也不盡相同，實驗中還需采用多個軟件分別進行預測后取交集以提高預測準確性。

1.3.2miRNA表達水平檢測：miRNA表達水平的檢測方法主要有miRNA基因芯片分析、Northern blot分析以及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。其中基因芯片主要應用于初步檢測miRNA表達模式，但其檢測結果可能存在一定的假陽性，后續可采用精確度較高的Northern blot以及RT-qPCR等方法進一步驗證。Northern blot可以檢測miRNA含量以及miRNA分子量大小，但是靈敏度較低(Valoczietal., 2004)。 由于成熟miRNA的長度僅為19～23 nt，必須要在反轉錄時延長miRNA序列才可以進行PCR擴增，常用的方法有莖環法和加尾法(表1)。莖環法使用特異莖環引物進行反轉錄，特異莖環引物包括一段通用莖環序列和一段與成熟miRNA 3′端反向互補的6～8個堿基，得到cDNA后用特異上游引物和通用下游引物進行PCR反應，引物既可用于PCR也可用于RT-qPCR；加尾法是在miRNA 3′端加一段Poly(A)尾，然后用帶有Poly(T)和一段接頭(adapter)引物進行反轉錄，隨后用特異性上游引物和試劑盒帶有的通用下游引物進行RT-qPCR擴增。

表1 莖環法與加尾法比較

1.3.3miRNA研究方法：miRNA的研究方法包括對miRNA進行抑制和過表達。抑制miRNA的表達有多種方法，在基因水平上包括：(1)利用CRISPR/Cas9等基因編輯工具將miRNA生物合成途徑中起重要作用的Dicer或AGO進行敲除，這將導致個體中所有成熟miRNA的缺失。Kettles等(2013)利用Dicer1和AGO1的缺失突變體擬南芥飼養桃蚜Myzuspersicae，結果顯示桃蚜在在突變寄主植物上產卵數較對照組明顯減少，表明miRNA能夠參與擬南芥與桃蚜的互作，但這無法確定具體是哪個miRNA參與了調控作用。(2)對miRNA調控位點進行突變，從而抑制miRNA與靶基因的結合。但由于miRNA和靶基因間并非“一對一”的調控關系，敲除單個miRNA后，其功能很可能從其他途徑得到補償。在非基因水平上抑制miRNA，目前較常用的是體外合成的miRNA抑制劑(inhibitor)或拮抗劑(antagomir)。antagomir是在inhibitor的基礎上，經過化學修飾的人工合成產品。與inhibitor相比，antagomir在動物體外穩定性較好，作用時間更長，且在體外細胞處理實驗中不需要借助細胞轉染試劑。

對miRNA進行過表達可以進一步揭示miRNA功能。在基因水平上，體內構建GAL4/UAS轉基因系統已成為過表達miRNA的有效方法，目前已成功應用于果蠅(Vargheseetal., 2010; Chen and Rosbash, 2016)和家蠶Bombyxmori(Liuetal., 2018)等昆蟲中。在植物中，過表達miR-14的轉基因水稻Oryzasativa可以對二化螟Chilosuppressalis產生高抗性(Heetal., 2019)，過表達Osa-miR162a可以誘導水稻中相關防御基因表達，增強對稻瘟病菌Magnaportheoryzae的抗性(Lietal., 2020)。在非基因水平，注射miRNA類似物(mimic)或激動劑(agomir)是較常用的實驗方法，mimic和agomir的作用與成熟miRNA相同，都可以上調細胞內相應miRNA的含量。隨著miRNA成為生命科學領域的新熱點，上述方法也成為了研究miRNA的得力工具。

2 昆蟲miRNA的鑒定

目前已有的報道主要是利用高通量測序技術以及生物信息學等新技術和新手段對不同昆蟲中的miRNA進行鑒定并分析其個體表達模式以及在不同應激條件下的表達情況，為研究miRNA的調控機制奠定基礎。到目前為止，在miRbase數據庫中已有從家蠶、果蠅和小菜蛾Plutellaxylostella等26種昆蟲中鑒定的3 508個miRNA(表2)。

表2 miRbase數據庫注冊的昆蟲miRNAs統計

2.1 鱗翅目昆蟲中miRNA的鑒定

Ellango等(2014)鑒定了小菜蛾中8個miRNA成熟體的同時預測了其靶標mRNA，并對這些miRNA的前體序列進行分析，通過最小自由能索引(MFEI)對其二級結構進行預測。Etebari和Asgari(2016)重新注釋了小菜蛾基因組，對其中高豐度miRNA的5p和3p端特征進行更正，并注釋了203個成熟miRNA，鑒定出其中160個pxy-miRNA的7 691個高豐度結合位點，為研究小菜蛾miRNA的功能提供數據支持。基于同源序列搜索以及Northern雜交，He等(2008)鑒定出了家蠶中46個miRNA、另外21個潛在的miRNA以及1個新的miRNA，并根據這些miRNA找到了12對miRNA-miRNA*雙鏈分子。Liu等(2010)在家蠶中初步鑒定得到了一些昆蟲變態相關的miRNA，并驗證了其組織特異性表達模式，為研究家蠶miRNA的功能提供了理論基礎。Fan等(2017)在滯育和經HCl處理后的家蠶的卵中共發現44個新的miRNA，其中經酸處理的卵中有23個miRNA表達量上調，3個miRNA表達量下調，說明經酸性物質處理后可能會影響家蠶卵中與生長發育相關的一些miRNA的表達。Zhang等(2015)在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中共鑒定出127個保守的miRNA，其中Sex-miR-10-1a, Sex-miR-9和Sex-miR-4924在昆蟲不同發育階段差異表達。Xu等(2015)在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的Cry1Ab敏感和抗性品系幼蟲中鑒定并驗證了22個已知的miRNA和1個新的miRNA表達量存在顯著差異。此外，Yu等(2018)對歐洲玉米螟OstrinianubilalisCry1Ab敏感品系和抗性品系幼蟲的中腸miRNA進行建庫測序，共得到248個已知的和29個新的miRNA，并驗證了抗性品系幼蟲中腸15個差異表達miRNA的表達模式。Zhang Z等(2018)鑒定了核桃舉肢蛾Atrijuglanshetaohei幼蟲期和成蟲期的miRNA，共得到132個已知的和7個新的miRNA，其中4個miRNA在成蟲期特異表達，17個在幼蟲期特異表達，RT-qPCR結果表明miR-8-3p, miR-305-3p和miR-2766均在幼蟲期高表達。Jeyaraj等(2017)在物理傷口、茶尺蠖Ectropisobliqua啃食造成的傷口以及正常的茶樹葉片中共鑒定出130個已知的和512個新的miRNA，其中36個已知的和139個新的miRNA在經茶尺蠖啃食葉片中特異表達，RT-qPCR結果證實了其中6個miRNA的表達模式，同時他們也發現這些miRNA的靶基因編碼了包含乙烯響應轉錄因子以及squamosa基因啟動子綁定蛋白在內的多個轉錄因子，說明miRNA可能通過調控轉錄因子的表達參與昆蟲應激反應。

2.2 其他昆蟲中miRNA的鑒定

Calla和Geib(2015)在橘小實蠅Bactroceradorsalis中鑒定了已知miRNA的75個直系同源miRNA和5個實蠅科特有的新miRNA，并構建了miRNA的基因表達譜，同時也預測了這些miRNA潛在的靶標基因，這為在其他雙翅目物種進行比較分析以及為新型害蟲防控策略提供潛在靶標奠定了基礎。在東方果實蠅Grapholitamolesta各個發育階段的miRNA中，共鑒定出291個已知的和245個新的miRNA，發現同簇的miRNA具有相關的表達譜，并對17個在節肢動物中保守的miRNA家族進行分析，結果表明這些miRNA家族在昆蟲中十分保守并具有更近的系統發育關系(Wang Xetal., 2017)。Lyons等(2016)對膽蠅Eurostasolidaginis幼蟲中與低溫耐受有關的miRNA進行研究，發現當溫度范圍在-15～5℃時，共有24個差異表達的miRNA，其中miR-92a在-15℃條件下時表達量明顯提高。在嗜人錐蠅Cochliomyiahominivorax和次生錐蠅Cochliomyiamacellaria的成蟲以及3齡幼蟲中共發現10個進化保守的miRNA和10個可能的前體miRNA，其中6個與生殖相關的miRNA的相對表達模式在這兩個物種中相似，說明miRNA調控模式在物種間具有一定的保守性(Pauloetal., 2017)。Seong等(2019)在果蠅DDT敏感和抗性品系中鑒定出10個差異表達miRNA，且其靶基因多與解毒代謝有關，這表明miRNA可能通過調節其靶基因的表達進而在DDT解毒通路中發揮一定的作用。對喂食血液、糖類和被瘧原蟲感染后的嗜人按蚊Anophelesanthropophagus中腸miRNA進行鑒定，發現與喂食糖類的按蚊相比，喂食血液的嗜人按蚊中腸中有9個miRNA的表達量顯著上調，10個miRNA顯著下調，而感染瘧原蟲使按蚊中腸中13個miRNA表達量增加，11個miRNA表達量下降(Liuetal., 2017)。Chang等(2016)在白背飛虱Sogatellafurcifera中共鑒定得到382個miRNA，其中有106個已知的miRNA和276個新的miRNA，并且半數以上的保守miRNA家族在六足類中也是高度保守的。Ylla等(2017)對德國小蠊Blattellagermanica胚胎形成的不同階段差異表達的miRNA進行測序，并將其與黑果蠅、黑腹果蠅以及赤擬谷盜T.castaneum的進行對比，發現了之前未研究過的一些胚胎細胞miRNA，例如miR-309家族和54個新的miRNA，這些miRNA可參與調控不同時期的胚胎發育過程。Wang YK等(2017)對雌性和雄性榕小蜂Ceratosolensolmsi不同齡期的miRNA進行鑒定后發現一些miRNA的表達具有很高的性別和發育階段特異性。在暗黑鰓金龜Holotrichiaparallela中鑒定得到了共76個已知的miRNA和23個組織特異表達的新miRNA，對其靶基因進行預測和功能分析后，發現其中有13個miRNA可能與昆蟲嗅覺有關(Wang Setal., 2017)。分別對6, 9和12日齡的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica咽下腺總miRNA進行分析，共得到54個在日齡間差異表達的miRNA，其靶基因被注釋到生理節律信號通路、Hippo信號通路、嘌呤代謝通路等，GO聚類主要集中在有機物質運輸、離子跨膜運輸和系統發育等，暗示這些差異表達miRNA可能與咽下腺發育有關(張衛星, 2020)。在耐寒和正常稻水象蟲Lissorhoptrusoryzophilus中鑒定得到共121個已知的和14個新的miRNA，其中36個miRNA在耐寒種群與正常種群之間差異表達(Yangetal., 2017)。Jung等(2017)根據東亞飛蝗Locustamigratoria的棲息地、性別和發育階段將其分為12組進行miRNA測序分析，共鑒定出175個miRNA簇，GO功能分析表明某些miRNA可以在多種生理過程中調節靶標mRNA的表達，從而影響多酚類的分泌。Liu M等(2019)對蘭州熊蜂Bombuslantschouensis的雄蜂、工蜂和蜂后腦中的miRNA進行測序，共鑒定得到了364個已知的和89個新的miRNA，并對差異miRNA進行RT-qPCR驗證和靶基因分析，為進一步研究miRNA在蜜蜂腦中的功能提供了基礎。

3 miRNA在昆蟲中的功能

3.1 miRNA與昆蟲生長發育

昆蟲的生長發育受蛻皮激素和保幼激素的協同作用，miRNA通過調節蛻皮激素級聯基因的表達影響昆蟲發育及變態過程。家蠶中miR-281特異作用于蛻皮激素受體(EcR)的一個亞型基因BmEcR-B的3′UTR區，通過抑制BmEcR-B的轉錄水平，延緩家蠶發育過程(Jiangetal., 2013)。miR-2家族作為無脊椎動物特有的家族，同時也在家蠶翅發育中扮演重要角色，miR-2轉基因個體在成蟲期出現翅畸形的現象，并可以顯著抑制靶基因Bmawd和Bmfng的表達(凌琳, 2017)。利用GAL4/UAS系統和CRISP/Cas9技術構建的家蠶miR-14轉基因過表達品系和敲除品系表明，當miR-14過表達時，家蠶產生滯育現象、蟲體重量降低且蛻皮激素滴度降低；miR-14敲除品系的家蠶則發生早熟行為，miR-14通過調控蛻皮激素信號通路上的核心因子ECR-B和E75影響家蠶生長發育及代謝(Liuetal., 2018)。滯育和經HCl處理后的家蠶的卵中差異表達miRNA的靶基因，多與細胞新陳代謝、蛋白質產生和運輸過程有關，其中Bmo-miR-2761-3p通過負向調控靶基因BmSDH的表達影響家蠶卵的發育，進而影響其生長發育(Fanetal., 2017)。Liu ZL等(2019)利用CRISPR/Cas9技術將物種特異的miR-2738敲除后，其性別決定相關靶基因BmPSI和BmMasc轉錄水平有所上升，這表明miR-2738可能是性別決定基因的一個調控因子，通過負向調控其靶標基因在家蠶性別決定過程中發揮作用。

miR-14作為無脊椎動物中的一個保守miRNA，在果蠅中已被證明可以抑制細胞凋亡驅動基因rapper,grim,hid及dronc的表達水平，延緩細胞凋亡過程(Xuetal., 2003)。miR-14在果蠅成蟲腦中通過調控一個鋅指蛋白基因sugarbabe，控制果蠅發育及代謝(Vargheseetal., 2010)。對miR-305分別進行過表達和抑制表達后，果蠅壽命明顯縮短和延長，過表達時會顯著抑制其編碼AMP的靶基因以及類胰島素肽基因dilp6的mRNA表達水平，表明miR-305不僅與果蠅壽命長短有關，還可能在果蠅老化中起作用，其異位表達很可能會加速果蠅的衰老(Uedaetal., 2018)。miR-252在果蠅蛹期和成蟲期一般呈現上調趨勢，在幼蟲脂肪體中過表達會使果蠅各組織重量下降，蛹期到成蟲期的發育歷期延長，將其敲除則使果蠅組織重量上升；同時過表達miR-252和靶基因mbt則會使果蠅的發育缺陷得到恢復，這表明miR-252可能通過調控mbt的表達參與果蠅的生長發育過程(Limetal., 2019)。東方果實蠅各個發育階段的miRNA進行從頭測序、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析和靶基因預測表明，由miRNA、時鐘基因和發育調控相關基因組成的復合物在調控東方果實蠅的生理發育節律中起著重要作用(Wang Xetal., 2017)。

埃及伊蚊作為蟲媒病毒的重要傳播載體，研究其生殖調控機制對制定蟲媒控制策略、限制蟲媒疾病的傳播有重要意義。Bryant等(2010)發現，miR-275在血液消化、流體排泄和卵的發育中均發揮重要作用。miR-1174在埃及伊蚊腸道中特異表達，并靶向絲氨酸羥甲基轉移酶基因(SHMT)以控制腸道內的血液攝入和消化，進而影響卵發育，miR-1174的缺失會導致糖吸收和血液攝入的嚴重缺陷(Liuetal., 2014)。miR-8通過調節雌蚊脂肪體內Wingless-interactingmolecule(Swim)的表達影響遠程Wingless(Wg)信號的傳導，miR-8/Wg對于脂肪體適當分泌脂激蛋白、卵黃生成素以及卵黃蛋白前體發育成卵母細胞后的積累至關重要(Lucasetal., 2015)。研究表明miR-309在卵巢發育啟動過程中充當調節開關的角色，吸食血液能夠刺激其表達；同時miR-309也參與介導SIX4周期性降解，使卵巢發育從卵黃發生前階段過渡到卵黃發生后階段，將其敲除會影響初級卵泡形成，導致卵巢發育受損，影響卵發育成熟(Zhangetal., 2016)。在埃及伊蚊中，miR-277也可以通過微調insulin-likepeptide7(ILP7)和ILP8的表達來調節脂質代謝，從而控制促性腺營養周期中卵巢發育啟動所需能量的轉移，將miR-277或靶基因ILP7/ILP8敲除后，均可導致昆蟲的脂質代謝和卵巢發育缺陷(Lingetal., 2017)。

發育同步性是群居動物適應環境的重要策略之一，是群居動物群體形成、遷移和性成熟的基礎。對群居型蝗蟲和寡居型蝗蟲的卵孵化時間進行的研究表明，群居型蝗蟲個體的性成熟同步性明顯優于寡居型蝗蟲，其中miR-276在群居型蝗蟲個體的卵巢和卵中的表達量均顯著高于寡居型蝗蟲，miR-276通過正向調控轉錄共激活因子Brahma(Brm)的表達使昆蟲后代同步孵化，對其進行干擾會導致昆蟲性成熟同步性的紊亂(Heetal., 2016)。在東亞飛蝗中miR-2/13/71簇(miR-2, miR-13a, miR-13b和miR-71)通過抑制靶基因Notch的表達，從而降低卵黃原蛋白(Vg)mRNA的轉錄水平，抑制卵母細胞成熟，影響東亞飛蝗的卵巢發育和生殖(Songetal., 2019)。

miRNA也與昆蟲幾丁質的合成過程有關。Yang等(2016)發現miRNA也與昆蟲幾丁質的合成過程有關，miR-71和miR-263通過調控其靶基因chitinsynthase1(CHS1)和chitinase10(CHT10)的表達影響蝗蟲蛻皮，注射miR-71和miR-276 agomir可顯著降低CHS1和CHT10的表達，影響新老角質層幾丁質的產生，導致蝗蟲的蛻皮缺陷。Chen等(2018)的研究表明在褐飛虱Nilaparvatalugens中，nlu-miR-173通過與轉錄因子NlFtz-F1結合參與20E信號通路，且Broad Complex (Br-C)可以提升nlu-miR-173的轉錄水平，進而在昆蟲蛻皮過程中發揮作用。miR-2703通過靶向chitinsynthase1a(CHS1a)響應20E信號通路以調節幾丁質合成，飼喂或注射miR-2703 mimic會導致昆蟲幾丁質合成降低、死亡率增加并出現蛻皮缺陷表型(Chenetal., 2020)。在長期適應自然環境的過程中，褐飛虱進化出長翅(LW)和短翅(SW)兩種翅型，其中胰島素受體(lnR)和保幼激素(JH)在調節翅多型性中起著重要作用，但是這些調節因子之間的相互作用尚未明確。Ye等(2019)發現，miR-34在短翅褐飛虱中高表達，通過抑制NllnR1的轉錄水平影響昆蟲的翅多型性現象，在長翅褐飛虱中過表達miR-34可促使其向短翅轉變，在短翅褐飛虱中敲除miR-34則會導致其向長翅轉變。該研究團隊還在nlu-miR-34的啟動子區發現了Br-C的順式響應元件，這表明20E可能參與了翅多型性現象的調控；此外，JH通過上調miR-34的表達水平誘導更多短翅褐飛虱的產生，敲除胰島素/IGF信號(IIS)通路上的某些基因也會使JH滴度和miR-34的豐度提高，這表明miR-34是JH， 20E和IIS通路間的一個重要調節因子，使其三者形成一個正反饋回路，協同調控昆蟲翅多型性(Yeetal., 2019)。

Zhang Z等(2018)鑒定了核桃舉肢蛾各個發育階段的miRNA，發現miR-1a-3p, miR-133, let-7, miR-2766, miR-184和miR-34可能與昆蟲背腹軸形成、激素合成以及生理節律等生長發育過程有關。在昆蟲翅形態發生、組織死亡及神經細胞轉導形成相關的miRNA中發現miR-2可以控制Kr-h1的轉錄水平，進而影響德國小蠊在半變態過程中的形態發育，這也是單個miRNA作為重要的調節因子影響昆蟲整個生理過程的典型例子(Belles, 2017)。Ylla等(2017)參考了德國小蠊的miRNA文庫，發現在不完全變態個體中，一些miRNA在蛹期和成蟲期會有多種表達模式，表明某些miRNA可以參與昆蟲發育過程，促進發育期的轉變，甚至可能影響胚芽帶類型和變態模式。赤擬谷盜中miR-8-3p與昆蟲的生長發育和變態過程密切相關，在幼蟲晚期抑制其表達會導致翅、眼、足及胚胎的發育缺陷，且靶基因Wingless,Eyg,Fpps和Sema-1a均與機體發育相關，其中Eyp和Wingless作為關鍵調控基因參與Notch和Wingless信號通路，并影響昆蟲變態(Wu Wetal., 2019)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的miRNA生物合成途徑中的關鍵基因Pasha,Drosha,Exportin-5,Dicer-1及Argonaute-1在不同組織和不同齡期中表達量均有差異，沉默Dicer-1可導致let-7和miR-184表達量上升，并會抑制miRNA生物合成途徑的發生，導致幼蟲死亡、蛹期延長和成蟲翅發育畸形(Rahimpouretal., 2019)。在斜紋夜蛾Spodopteralitura中，miR-14-3p通過靶向兩個蛻皮激素級聯基因EcR和E75來調節昆蟲蛻皮激素信號通路。此外，EcR,E75和Kr-h1等蛻皮激素級聯基因不同轉錄本間的3′UTR區基本相似，表明一個miRNA也可能調控一個蛻皮激素級聯基因的多個轉錄本(Luoetal., 2020)。橘小實蠅的miR-1-3p在雌性性別決定基因Bdtra上存在靶位點，通過抑制其表達影響橘小實蠅的性別分化，注射miR-1-3p mimic會導致87%～92%的雄性表型，注射inhibitor則會導致67%～77%的雌性表型，敲除miR-1-3p后會導致Bdtra和Bddsx的雌性特異剪接轉錄本的表達，并且誘導XY個體的性別逆轉為雌性(Pengetal., 2020)(表3)。

表3 昆蟲生長發育相關miRNAs及其靶基因

續表3 Table 3 continued

3.2 miRNA與昆蟲行為

在東亞飛蝗兩型轉變的行為中，miR-133靶向多巴胺合成通路的兩個關鍵基因henna和pale，下調其表達會抑制多巴胺合成，促使飛蝗由群居型轉變為寡居型(Yangetal., 2014)。D1-like dopamine receptor(Dop1)通過阻止La蛋白和pre-miR-9a結合，抑制成熟miR-9a產生，上調其靶基因AC2的表達水平，進而誘導東亞飛蝗對群居性揮發物的嗅覺偏好(Guoetal., 2018)。Sadd等(2015)通過對歐洲熊峰Bombusterrestris和美洲東部熊蜂Bombusimpatiens進行研究，并將其與蜜蜂以及其他膜翅目昆蟲進行比較，發現其miRNA的差異表達很可能與調控社會行為或其他行為特征的基因有關。跳舞作為西方蜜蜂Apismellifera特有的傳輸方向和距離的交流方式，其中也不乏miRNA參與。對處于不同覓食階段工蜂的研究表明，ame-miR-278和ame-miR-282在跳舞階段的表達量低于覓食階段，其靶基因均與激酶、神經功能以及突觸結合蛋白等相關，覓食和舞蹈階段的miRNA差異很可能與蜜蜂的跳舞行為有關(Lietal., 2012)。果蠅的miR-276a通過抑制重要的時鐘基因timeless(tim)的表達調控其行為節律，敲除tim中miR-276a的結合位點會導致tim表達量上升，致使果蠅心律失常(Chen and Rosbash, 2016)。miR-210通過抑制Fasciclin2(Fas2)來決定果蠅的夜間行為，miR-210缺失會導致果蠅提前2 h出現夜晚的某些行為，敲除Fas2上miR-210的靶位點也會導致果蠅夜間行為的提前(Niuetal., 2019)。一些miRNA還可能與昆蟲的求偶行為有關，研究表明黑腹果蠅的求偶行為有時會根據求偶對象釋放的信號而改變，這一適應性的行為被廣泛認為是miRNA和其他因子共同作用的結果。miR-957突變體果蠅呈現顯著上升的雄-雄求偶行為和雄性群體中互相求偶的鏈式行為，這表明單個miRNA也可能調控多種復雜行為(Iftikharetal., 2019)。在感染Wolbachia的果蠅中，dme-miR-92b通過負向調節其靶基因crebA的表達影響果蠅的神經發育和學習記憶能力(Bietal., 2019)。盡管miRNA對神經元可塑性的調節作用被認為是真核生物中的一種保守機制，但僅有少量研究表明，miRNA也可以在昆蟲學習與記憶方面發揮作用(Rajasethupathyetal., 2009; Linetal., 2011)。Cristino等(2014)發現，在蜜蜂中與神經蛋白相關的miR-932可通過調節肌動蛋白基因Act5C的表達對蜜蜂的長期記憶產生影響，該miRNA的缺失導致蜜蜂長期記憶的損傷，但并不會影響其記憶的獲取(表4)。

表4 昆蟲行為相關miRNAs及其靶基因

3.3 miRNA與昆蟲抗病毒機制

目前，miRNA與抗病毒機制的相關研究主要集在果蠅和家蠶這兩種模式生物中。病毒主要通過調節宿主免疫反應和逃避宿主免疫系統識別等方法達到持續感染宿主細胞的目的(Stern-Ginossaretal., 2007; Xiaetal., 2008)。在與宿主長期的互作過程中，病毒也進化出多種策略逃避宿主免疫系統識別，其中利用miRNA對宿主進行干擾有助于病毒的快速傳播(Tangetal., 2019)。對病毒感染下的miRNA表達模式進行分析已成為尋找宿主昆蟲-病毒互作相關miRNA的主要方法。

3.3.1病毒編碼的miRNA與宿主昆蟲-病毒互作：病毒可以通過編碼miRNA調節宿主基因表達，從而參與宿主昆蟲與病毒互作的生物過程。病毒編碼的miRNA具有長度短、非抗原性以及靶點特異性等優勢，這使其成為病毒對抗寄主防御機制的潛在武器。第一個鑒定得到的昆蟲病毒miRNA是由棉鈴蟲囊泡病毒(Heliothisvirescensascovirus, HvAV)編碼的HvAV-miR-1，其表達可以引起病毒DNA聚合酶Ⅰ的降解，從而抑制病毒復制(Hussainetal., 2008)。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一種天然病原體，侵染后能有效調控宿主基因表達并在體內產生大量的病毒后代，染病家蠶死亡率極高，對桑蠶業造成了嚴重的經濟損失。為探究BmNPV與宿主防御系統的互作機制，Singh等(2010)預測了部分病毒編碼的miRNA以及其64個潛在靶點，揭示了miRNA可以通過調控部分病毒復制基因和寄主免疫防御通路關鍵基因的表達，從而在促進病毒侵染宿主昆蟲的過程中發揮作用。此外，一些病毒miRNA也可能通過抑制宿主miRNA合成途徑中的重要蛋白合成對昆蟲抗病毒能力產生影響，例如BmNPV可通過編碼一種miRNA(BmNPV-miR-1)，下調寄主GTP結合核蛋白Ran的表達，使Ran與Exportin-5的結合效率降低，抑制了miRNA前體從細胞核到細胞質的遷移，從而增加感病家蠶中BmNPV的拷貝數(Singhetal., 2012)。該研究團隊還發現在BmNPV病毒感染早期，BmNPV-miR-3可以通過負調控病毒P6.9和其他晚期基因的表達來逃避宿主的免疫防御，促進BmNPV對宿主的感染(Singhetal., 2014)。除BmNPV外，家蠶細胞質多角體病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV)也是一種嚴重危害養蠶業的重要病原體。Guo等(2020)研究表明，BmCPV-miR-1通過上調凋亡蛋白抑制基因BmIAP的表達抑制感病家蠶的細胞凋亡，為病毒的復制提供更好的細胞環境。

3.3.2昆蟲編碼的miRNA與宿主昆蟲-病毒互作：有些昆蟲編碼的miRNA在受到病毒感染后會發生表達譜變化，這種變化揭示了昆蟲miRNA在宿主-病毒互作中的潛在作用。Monsanto-Hearne等(2017)通過對比感染了果蠅C型病毒(DrosophilaC virus, DCV)和未染病果蠅的miRNA表達譜，發現二者之間miR-956-3p的豐度存在顯著差異，該miRNA通過在DCV感染期間誘導其靶基因Ectoderm-expressed4(Ect4)的表達，降低病毒聚集率，延緩果蠅死亡，啟動染病果蠅體內的宿主保護機制和抗病毒機制。Wu P等(2019)發現在感染BmNPV的家蠶中，bmo-miR-2819的表達下調，過表達該miRNA后其靶標基因BmNPVIE-1的豐度相應降低并抑制了病毒的復制，這表明宿主miRNA可以通過調控病毒基因的表達抵御病毒的侵染。

某些病毒也可以利用宿主細胞miRNA加速自身復制過程，促使宿主昆蟲染病。Wu等(2016)研究表明，在感染BmCPV的家蠶幼蟲中，過表達miR-278-3p可以顯著降低其靶基因Insulin-relatedpeptidebindingprotein2(IPB2)的表達，同時顯著提高BmCPV的mRNA轉錄水平，加速其復制。此外在染病幼蟲中，miR-273-3p也能夠通過負向調控病毒Nonstructuralprotein5(NS5)基因的表達，增加BmCPV的拷貝數，加速家蠶染病過程(Wuetal., 2017)。Campbell等(2014)構建了經登革熱2型病毒(DENV-2)處理2, 4和9 d后的埃及伊蚊Aedesaegypti深度測序文庫，發現經過9 d的處理后，起顯著調節作用的miRNA數量由5個上升為23個，對這些miRNA的靶標基因進行預測后，發現其均與轉錄調節、信號轉導、染色質修復和線粒體功能等病毒復制傳染過程有關。蜜蜂作為重要的昆蟲傳粉者，感染病毒后其授粉效率顯著降低，感染緩慢性蜜蜂麻痹病病毒(slow bee paralysis virus, SBPV)和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)的歐洲熊蜂Bombusterrestris的miRNA合成通路基因以及表達模式分析顯示，在SBPV侵染后Dicer-1和Ago-1的表達量有所提高，且有17個miRNA在SBPV感染群體特異表達，12個miRNA在IAPV感染群體中特異表達，對這些miRNA的靶基因進行分析后發現寄主昆蟲miRNA可能會靶定調控病毒基因組RNA(Niuetal., 2017)。在埃及伊蚊中，感染沃爾巴克氏菌Wolbachia可顯著誘導aae-miR-2940和其靶基因metalloprotease(MetP)的表達，沉默aae-miR-2490和MetP則會導致體內外Wolbachia密度降低，宿主miRNA可通過調節胞內環境以促進Wolbachia內共生，與病原菌進行互作(Hussainetal., 2011)。Dubey等(2019)發現，miR-2944b-5p通過與基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)的3′UTR結合影響病毒復制，注射antagomir抑制miRNA會導致病毒復制加快，此外，在病毒復制過程中，miR-2944b-5p靶向vps-13以維持埃及伊蚊線粒體膜電位。Su等(2019)對喂食DENV-2污染血液后染病和未染病埃及伊蚊的miRNA分析發現17個顯著差異表達的miRNA, miR-1767和miR-276-3p會加速病毒復制，miR-4448則會減緩病毒復制(表5)。

表5 與昆蟲-病毒互作相關的miRNAs及其靶基因

3.4 miRNA與昆蟲免疫機制

昆蟲作為無脊椎動物沒有適應性免疫，當被外源病原體入侵時，主要通過Toll途徑和免疫缺陷(IMD)途徑激活體內的細胞免疫和體液免疫，細胞免疫主要包括淋巴細胞介導的吞噬、包被和結節作用，體液免疫是通過昆蟲脂肪體產生體液反應分子，如抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)以及一些抗病毒因子和黑色素等來實現的(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。其中，AMP的產生、黑化以及細胞吞噬作用是最重要的防御機制。由于miRNA在轉錄后水平調控基因表達，其在昆蟲免疫機制中也可能發揮著重要作用。在球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染后的斯氏按蚊Anophelesstephensi的研究中發現，在侵染早期，bba-milR-1可以顯著下調宿主Spz4的表達，進而抑制Toll介導的蚊蟲免疫；但在侵染晚期，真菌菌絲進入昆蟲血腔后，bba-milR-1和靶基因CLIPB9的表達均顯著降低以避免酚氧化酶原(PPO)轉化為酚氧化酶(PO)，進而避免蚊蟲黑化反應的激活(Cuietal., 2019)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，aga-miR-305可以通過免疫效應基因的轉錄后修飾對抗瘧原蟲的中腸微生物群進行調節，從而影響昆蟲的免疫機制(Dennisonetal., 2015)。通過對種系缺陷的秀麗隱桿線蟲的壽命和免疫機制的研究發現，一些miRNA的調節因子與昆蟲的壽命延長有關(Sinha and Rae, 2014)。miR-8是一個昆蟲中高度保守的miRNA，在調節昆蟲發育、內分泌以及先天免疫內穩態中起著重要作用(Karresetal., 2007; Kennelletal., 2008, 2012; Jinetal., 2012)。對果蠅Toll, IMD和JNK免疫通路上一些保守miRNA分析發現，miR-8可能通過靶標Toll通路上的GNBP3和JNK通路上調節因子Pvf來調控AMP的表達，進而在果蠅先天免疫反應中發揮作用(Fullaondo and Lee, 2012)。在小菜蛾中，miR-8可以正向調控絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Serpin27的轉錄水平，調節免疫反應中Toll途徑的激活；并且在感染了寄生蟲的彎尾姬蜂Diadegmasemiclausum體內，miR-8的下調會導致Serpin27的表達量顯著降低，進而導致Toll途徑的激活和AMP的大量產生，同時也促進PO活性的增強以及黑化反應的激活(Etebari and Asgari, 2013)。Xiong等(2016)發現，miR-34通過抑制其靶基因Dlg1和Eip75B的表達調節果蠅先天免疫并參與蛻皮激素信號通路，是二者復雜的相互作用中的關鍵節點，過表達miR-34可以激活天然抗菌免疫信號，使感染革蘭氏陰性菌的果蠅存活率和病原菌清除率均有所提高。Wei等(2018)在3個時間點對感染了滕黃微球菌Micrococcusluteus的果蠅雄成蟲進行miRNA和mRNA表達模式分析，發現感染后的各個時間點，miRNA和mRNA的表達量均有差異，說明一些差異表達的基因在Toll等信號通路中起著重要作用，miRNA可能在不同的信號通路中協同調節基因表達，促進或抑制昆蟲先天免疫反應以及維持昆蟲自穩態。果蠅中miR-317可直接靶向Dif基因的一個轉錄本Dif-Rc以下調Drc的表達水平，且miR-317僅作用于Dif-Rc，而不作用于Dif-Ra/b/d，表明miR-317可以調節一個可變剪接基因的不同亞型從而負向調控果蠅的免疫應答；此外，過表達miR-317會提高果蠅革蘭氏陽性菌感染死亡率，敲除miR-317則會降低其死亡率，因此miR-317不僅可以影響果蠅的先天免疫功能，還可以通過干擾免疫系統影響果蠅生存(Li Retal., 2019)。Xu等(2017)建立了感染玫煙色棒束孢Isariafumosorosea的小菜蛾miRNA文庫，并驗證了其中23個差異表達miRNA的表達模式發現miR-2, miR-9a, miR-745和miR-7b均在小菜蛾抵御病原菌的過程中發揮作用(表6)。

3.5 miRNA與昆蟲抗藥性

傳統農業生產上對化學農藥的過度依賴導致了害蟲抗藥性的產生，解決重大農業害蟲的抗藥性問題已成為了目前害蟲防治工作的重中之重。由于miRNA在基因轉錄后調控中扮演著重要的角色，其通過調節昆蟲解毒基因表達來增強自身抗藥性的分子機制也引起了廣大害蟲防控工作者的興趣(表7)。Li等(2015)的研究首次表明，小菜蛾可利用miR-7a和miR-8519上調魚尼丁受體(ryanodine receptor, RyR)的表達，進而增強對氯蟲苯甲酰胺的抗性。這證實了miRNA可以通過調控宿主靶基因的表達從而參與其對殺蟲劑的解毒過程。經氯蟲苯甲酰胺處理后，小菜蛾幼蟲體內miR-2b-3p和miR-14-5p的豐度顯著降低，其靶基因CYP9F2和CYP307a1在轉錄水平上過表達，并通過飼喂幼蟲miR-2b-3p mimic，發現溴氰菊酯抗性品系幼蟲死亡率明顯提高，表明miR-2b-3p可以負向調節CYP9F2的表達，并有效抑制幼蟲解毒代謝通路(Etebarietal., 2018)。隨后Li S等(2019)構建了暴露在Bt下不同時長的小菜蛾miRNA文庫并進行了差異miRNA表達分析，發現miR-2的表達量在殺蟲劑暴露后有所上調，且miR-2b-3p可負向調控trypsin的表達，這表明miR-2b-3p可能在小菜蛾對蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)的防御機制中發揮作用。Zhu等(2019)的研究表明，miR-998-3p通過負向調控ABCC2的表達，參與棉鈴蟲H.armigera、甜菜夜蛾和小菜蛾這3種典型的鱗翅目害蟲對BtCry1Ac毒素的解毒過程。Zhang Y等(2018)發現在朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus中，屬于miR-1家族的tci-miR-1-3p在抗性品系幼蟲中的表達量很低，在tci-miR-1-3p過表達時，該miRNA的一個預測靶基因TCGSTM的表達量明顯降低，利用雙熒光素酶報告系統實驗進一步證實了兩者之間存在明顯的相互作用，這表明tci-miR-1-3p通過調節TCGSTM的表達，進而在螨類對丁氟螨酯的抗性中發揮重要作用。Morin等(2017)驗證了經吡蟲啉處理和未經處理的馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata中的miRNA的表達模式，發現miR-282, miR-989和miR-100在昆蟲對吡蟲啉的解毒中發揮重要作用，并揭示了響應吡蟲啉刺激的馬鈴薯甲蟲miRNA的特征。對西方蜜蜂的噻蟲嗪抗性品系和敏感品系中的miRNA鑒定發現，有7個miRNA在兩個品系中差異表達，其靶基因多與昆蟲行為、免疫功能、神經功能以及對殺蟲劑的解毒作用等相關(Shietal., 2017)。Lei等(2014)發現，miR-278-3p通過負向調控其靶標基因CYP6AG11的表達改變淡色庫蚊C.pipienspallens對擬除蟲菊酯的敏感性。此外，Guo等(2017)首次對淡色庫蚊中的miRNA簇進行研究，發現miR-2～13～71可通過調節其靶基因CYP9J35和CYP325BG3的表達參與昆蟲對擬除蟲菊酯的解毒過程。同樣在淡色庫蚊中，miR-932通過負向調控其靶基因CpCPR5的表達改變其對溴氰菊酯的敏感性(Liuetal., 2016)。Ma等(2017)發現miR-92a在溴氰菊酯抗性品系中相對于敏感品系過表達，進一步通過注射抑制劑將miR-92a抑制后可導致其靶基因cpCPR4表達量增加，同時抗性品系對溴氰菊酯的易感性也有所提高。該研究團隊還發現miR-13664在敏感品系中的豐度顯著高于抗性品系，過表達或抑制其表達會顯著影響淡色庫蚊對溴氰菊酯的敏感性，下調其靶基因cpCYP314A1的表達會降低淡色庫蚊對溴氰菊酯的抗性(Sunetal., 2019)。上述淡色庫蚊耐藥機制相關研究均為防治蚊蟲抗藥性提供了新的科學依據。Seong等(2019)的研究表明，DDT處理會顯著下調果蠅Canton-S敏感品系中miR-310-3p, miR-311-3p, miR-312-3p, miR-313-3p和miR-92a-3p的表達，這與其細胞色素P450相關靶基因的表達模式相反，表明這些miRNA可能通過轉錄后調控P450靶基因的表達從而參與對DDT的解毒代謝過程。

表6 昆蟲免疫相關miRNAs及其靶基因

表7 昆蟲抗藥性相關miRNAs及其靶基因

4 小結與展望

自20世紀90年代首次報道以來，miRNA日漸成為生命科學領域研究的新熱點。隨著生物信息學、生物化學與分子生物學和遺傳學等各個領域的研究不斷深化以及測序技術的飛速發展，研究人員已完成了多個物種的miRNA的鑒定和功能驗證。此外，以生物信息學為基礎的各種預測軟件的面世和轉錄組學的發展，揭示了miRNA和其靶基因之間潛在的復雜調控網絡以及miRNA在調節各種生物學過程中的功能可塑性，擴展了人們對基因轉錄后調控進程的理解。值得注意的是，miRNA與其靶基因之間的調控網絡可能還存在其他重要的調節因子，例如一些轉錄因子可與啟動子結合激活或抑制基因表達。在一些情況下，miRNA的缺失或突變不會引起生物體表型的顯著變化，但轉錄因子的突變則可以造成顯著的表型變化。多種生物的全基因組遺傳分析也表明轉錄因子在生物體發育和自穩態等過程中發揮決定性作用，而miRNA則是通過微調靶基因的表達，進而對生物體的形態、生理及行為產生影響，此時轉錄因子可作為調控共同靶基因的“主因子”，miRNA則起輔助作用，二者協同參與基因表達調控網絡(Martinez and Walhout, 2009)。因此，今后在研究miRNA的功能時可能也需要考慮到其他因子對靶標基因的調控作用。

昆蟲作為和人類生產生活聯系較緊密的物種，其miRNA的鑒定及其生物學功能的研究也越來越受到重視。大量研究表明，miRNA可以通過調節靶標基因的表達，參與多種生物學進程，如昆蟲生長發育、行為、昆蟲-病毒互作、昆蟲免疫和昆蟲抗藥性。其中，大量的miRNA已被證明在昆蟲蛻皮、變態、卵子發生、胚胎發育、翅發育和性別分化等方面均發揮著重要的作用，并與昆蟲行為變化有著千絲萬縷的聯系。在昆蟲-病毒互作關系中，病毒編碼的miRNA一方面可以提高病毒復制相關基因的表達，加速病毒侵染，另一方面也可以抑制宿主免疫相關基因的表達，從而使病毒能夠順利侵染宿主昆蟲。為抵御病毒侵染，昆蟲宿主miRNA可以通過多層次的調控機制調節自身免疫相關基因，進而激活昆蟲免疫應答或抑制病毒復制。為適應殺蟲劑這一重要的環境應激因子，昆蟲miRNA一般通過靶向過表達或抑制殺蟲劑靶標基因或解毒酶基因的表達來形成或增強殺蟲劑抗性。開展對昆蟲miRNA的功能研究，有利于提高我們對昆蟲基因表達調控網絡的深入理解，同時利用特定miRNA調控昆蟲抗藥性和免疫防御通路上的重要靶基因，也為害蟲生態防控策略的制定提供了新思路。

此外，miRNA還可用于轉基因植物中，抑制害蟲的關鍵靶標基因，阻礙害蟲發育，或通過干擾害蟲消化系統以阻止它的取食行為，避免造成更大的危害。也可以通過改造家蠶和蜜蜂等經濟昆蟲致命病原體的載體，使其產生抗病毒或抗寄生蟲的miRNA，抑制病毒復制和寄生蟲繁殖，預防家蠶和蜜蜂等經濟昆蟲的疾病。

雖然昆蟲miRNA的功能研究已經取得了較大進展，但依舊存在一些不足之處，如在非模式昆蟲中，對于CRISPR/Cas9系統介導的基因敲除和基于轉基因技術的基因敲入相關研究與應用相對較少，使得目前對大量新發現的miRNA的功能驗證存在一定難度。

對于某些在脊椎動物和無脊椎動物中系統發育高度保守的miRNA和一些在生長發育、形態發生、細胞分化、神經發生、凋亡和肌肉發育調控途徑這些保守通路上的miRNA來說，一些模式昆蟲可作為理想的研究材料，對這些昆蟲中的保守miRNA的研究也有利于深入了解癌癥和心臟病等疾病的分子機制。