中華蜜蜂氣味結合蛋白AcerOBP14的表達及配體結合特性分析

彭 竹, 黃 麗, 趙淑果, 呂建華, 趙慧婷

(山西農業大學生命科學學院, 山西太谷 030801)

昆蟲具有靈敏的嗅覺系統，能夠通過識別環境中的氣味分子來進行覓食、交配、躲避敵害以及尋找棲息地等一系列行為。例如，小菜蛾Plutellaxylostella能夠根據芥菜油異硫氰酸酯的含量來識別十字花科伯內特家族的成員(Verkerk and Wright, 2008)。觸角是昆蟲感受外界環境氣味分子，嗅覺發生的主要器官。在昆蟲觸角外周嗅覺系統中參與化學感知過程的蛋白主要包括氣味結合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、嗅覺受體(olfactory receptors, ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)(Sánchez-Graciaetal., 2009; Leal, 2013)。其中，OBPs是昆蟲嗅覺識別中的關鍵蛋白。昆蟲OBP于1981年在雄性多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus的觸角中首次被發現(Vogt and Riddiford, 1981)，目前OBPs已在鱗翅目(Sunetal., 2017a)、鞘翅目(Lietal., 2017)、雙翅目(Zhao Yetal., 2018)、膜翅目(Zhaoetal., 2016)、直翅目(Jiangetal., 2018)和半翅目(Sunetal., 2017b)等多類昆蟲中鑒定獲得。

OBPs是一種低分子量的水溶性球蛋白，可以通過與氣味分子形成復合物穿過淋巴液，然后與嗅覺神經元樹突膜上的ORs相互作用，將化學信號轉變為電信號，傳至中樞神經系統后，指導昆蟲產生相應的行為反應(Pelosietal., 2018)。根據OBPs序列的保守性和功能可以分為3類：信息素結合蛋白(PBPs)、一般氣味結合蛋白(GOBPs)和觸角特異性蛋白(ASPs)(Zhou, 2010)。OBPs的構象受到pH值的影響，與神經元膜表面的鄰近性有關，從而介導揮發性分子的結合和釋放(Sandleretal., 2000; Wei and Leal, 2008)。一般來說，在中性環境中，OBP與配體的結合親和力更高(Lietal., 2018)。此外，由于OBP體積小、可溶性強、穩定性好、易于操作和修飾，是更易于研究的目標(Britoetal., 2016)。多年來，研究者們致力于在體外模仿生物體的嗅覺感知能力，以期實現構建高靈敏、高特異性的嗅覺生物傳感器，拓展其在環境監測、食品檢測及疾病診斷等領域的應用及發展(Larisikaetal., 2015; 盧妍利, 2017)。

近年來，由于熒光競爭結合實驗操作簡單、便宜經濟、結果穩定，被廣泛應用于研究昆蟲OBPs與氣味物質的結合能力(彭竹等, 2020)，如小菜蛾PlutellaxylostellaOBP31(覃江梅等, 2016)、棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraOBP16(李兆群等, 2017)、甘薯蟻象CylasformicariusOBP8(賈小儉等, 2019)、西方蜜蜂ApismelliferaOBP14(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisOBP14(Sunetal., 2019)等與化合物的結合能力。

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱“中蜂”)是東方蜜蜂Apiscerana的指名亞種，為我國獨有的蜜蜂品種，與意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡稱“意蜂”)同是傳統農業的重要傳粉昆蟲。中蜂具有飛行迅捷、嗅覺靈敏、抗逆性強和善于采集零星蜜粉源等優點(趙慧婷等, 2015)。目前對中華蜜蜂OBPs的研究主要集中在基因的時空表達和蛋白結構預測分析上，對其重組蛋白表達及功能的報道較少。為深入研究中蜂嗅覺基因的功能，在本課題組前期測定的中華蜜蜂觸角轉錄組數據 (Zhaoetal., 2018)的基礎上，從中篩選出了觸角上特異性表達的氣味結合蛋白基因AcerOBP14，并對其進行了克隆和時空表達分析(杜亞麗等, 2016)，結果顯示AcerOBP14在20日齡中蜂觸角中表達量最高。為進一步探究AcerOBP14 在20日齡這一階段中蜂嗅覺感知中的功能，本研究選擇了中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日齡中蜂成年工蜂及20日齡中蜂成年雄蜂的觸角樣本，分析比較了OBP14在各樣本中的表達量，測定了AcerOBP14重組蛋白與植物揮發物、信息素等氣味化合物的結合特性。該研究不僅為OBP14在中蜂和意蜂中的功能比較奠定基礎，也有助于深入解析OBPs在中蜂獨特的生理行為中發揮的作用，為其在農業生產中的應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

實驗用蜜蜂均采自山西農業大學實驗蜂場。選取群勢強壯、健康無病、無自然分蜂傾向的蜂群，從中蜂群中分別抽出成熟封蓋的工蜂子脾、雄蜂子脾置于人工培養箱恒溫培養，待其羽化出房后用無味無毒的記號筆在背部進行標記(約 2 000 頭)，標記后再放回原來的蜂箱， 待20日齡時采集工蜂和雄蜂(選取的中蜂雄蜂是16∶00時左右交配返回蜂巢的，此時的雄蜂處于性成熟階段)，采集時用消毒鑷輕輕夾住蜜蜂的胸部，收集至木盒中。另外，在巢門口采集后足攜帶花粉的中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂。在蜜蜂巢門口，用消毒鑷輕輕夾住中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂胸部，收集至木盒中。每個樣本需采集蜜蜂300頭，隨機分為3組，分離觸角，每100對觸角混樣作為一個生物學重復。采集后的樣品要迅速投入盛有液氮的研缽中，速凍并研磨至粉末狀隨后置于含有 1 mL Trizol 的離心管中，-80℃保存備用。

1.2 質粒、細胞與試劑

中蜂AcerOBP14重組蛋白原核表達質粒pET28a/AcerOBP14以及大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態細胞均由本實驗室保存。總RNA 提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；cDNA 第1 鏈合成試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和熒光定量試劑盒SYBR PremixEx TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司；固相RNase清除劑、凝血酶和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自北京索萊寶科技有限公司；His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)購自康為世紀生物科技有限公司；色譜級甲醇購自TEDIA 公司；1-NPN(N-苯基 -1-萘胺，N-phenyl-1-naphthylamine)購自梯希愛公司(純度>97%)；氣味標品均購自阿拉丁試劑有限公司；其他均為國產分析純試劑。

1.3 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

按照Trizol試劑說明書進行1.1節觸角樣本總 RNA 的提取，經純度和濃度測定之后，根據反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)合成cDNA 第1鏈，反應所需 RNA 總量為 1 μg。獲得的 cDNA 模板置于-20℃保存備用。

1.4 qRT-PCR測定基因表達量

以1.3節合成的4種觸角樣本cDNA為模板，利用在線工具 Primer3Plus(http:∥www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設計引物序列，選擇東方蜜蜂的Arp1(GenBank登錄號: HM640276.1)為內參基因(正向引物序列：5′-ACTACGGCCGAACGTGAAAT-3′；反向引物序列：5′-GGAAAAGAGCCTCGGGACAA-3′)。 參考AcerOBP14(GenBank登錄號: KT246482)設計擴增OBP14的引物(正向引物序列：5′-GGCTTTTGCATTTGCGT TGG-3′；反向引物序列：5′-CAATGCCAGTTTCTGT GGCG-3′)。使用 SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行qRT-PCR，反應體系(15 μL): SYBR? Premix Ex TaqTMII(2×)7.5 μL, 2×ROX Reference Dye II 0.4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 模板 1.5 μL, 滅菌超純水 4.4 μL。反應程序: 95 ℃預變性 30 s; 95℃變性 5 s, 60℃退火 30 s, 共 42個循環。熔解曲線的反應條件: 95℃ 15 s, 60℃ 1 min。以OBP14在20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達量為基準，每個樣品進行3 次技術重復。

1.5 重組蛋白的誘導表達和分離純化

活化含重組表達載體pET28a/AcerOBP14的大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒后重新轉進BL21(DE3) 感受態細胞，平板涂布后，挑取獲得的單克隆菌落接種于3 mL LB 培養基(含Kan 30 μg/mL) 中，37℃ 220 r/min振蕩培養過夜,活化后按1∶1 000比例(v/v)轉接至10 mL LB培養基(含Kan 50 μg/mL)，振蕩培養至OD600為0.8左右;取1 mL菌液作為陰性對照，再向原菌液加入IPTG至終濃度為0.5 mmol /L，轉速設置為200 r/min，分別于20, 28和37℃下繼續誘導，6 h后對電泳圖進行分析，確定最佳誘導溫度。

將200 mL 誘導后的含pET28a/AcerOBP14的菌液，12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集至50 mL離心管中，加入20 mL裂解緩沖液充分懸浮菌體后，間斷超聲30 min， 4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清和沉淀，確定重組蛋白的位置。沉淀經結合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L咪唑， 0.5 mol/L NaCl， 8 mol/L尿素)重懸后，經 0.22 μm微孔濾膜過濾，然后用鎳柱純化目的蛋白。用不同濃度(15, 30, 50, 80, 100, 300和500 mmol/L)咪唑洗脫緩沖液對鎳柱進行梯度洗脫，之后經SDS-PAGE檢測，將含有目的蛋白的洗脫液轉移至透析袋中(截流量3.5 kD)，在Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中4℃透析24 h，期間更換新鮮的Tris-HCl緩沖液3次,用超濾凝縮管(Millipore，截留分子量為 10 kD)濃縮后，用凝血酶切除 His-tag，參照His 標簽蛋白純化說明書再次進行親和層析蛋白純化。將純化后的目的蛋白分裝至2 mL離心管中，置于-80℃保存。

1.6 重組蛋白濃度測定

Bradford法測定蛋白濃度，標準蛋白BSA用雙蒸水稀釋成7個濃度梯度(0, 24, 48, 60, 72, 84, 96和120 μg/mL)制作標準曲線。在每孔中加入1×G250考馬斯亮藍500 μL，然后將稀釋好的 BSA標準品和待測品分別加入 96 孔板中，每孔 180 μL，顛倒混和數次后室溫放置10 min，在酶標儀595 nm波長處測定吸光度值，重復測定3 次，根據標準曲線方程計算用于熒光競爭結合實驗的重組蛋白AcerOBP14樣品的蛋白濃度。

1.7 熒光競爭結合實驗

本實驗選取了4種信息素和23種植物揮發物。熒光分光光度計(RF-5301PC型)為日本島津公司生產。具體步驟如下：設置熒光分光光度計激發光波長為337 nm，掃描發射波長范圍360～550 nm，狹縫寬度為3 nm，靈敏度為高。在熒光比色皿中加入1-NPN和AcerOBP14蛋白的混合液(終濃度均為1 μmol/L)，靜置2 min使充分反應，測定熒光強度，然后將溶于甲醇的氣味標樣(終濃度為1 μmol /L)依次加到熒光比色皿中，濃度從1～10 μmol/L 依次遞增，靜置2 min，待熒光強度穩定后，記錄最大熒光值。

為了測定蛋白的結合濃度，以337 nm(最大發射光譜處)的熒光強度值對1-NPN濃度作圖。Scatchard 法線性化該曲線。假設蛋白活性為100%，并且在飽和狀態下，蛋白與氣味化合物1∶1結合，根據氣味化合物的IC50值(氣味化合物替換50%探針時的濃度)，計算氣味化合物的解離常數Ki(Ki=IC50/[I+(1-NPN)/K1-NPN])。計算公式中，1-NPN是未結合1-NPN濃度，K1-NPN為OBP/1-NPN復合物的解離常數。解離常數越小，表示蛋白與氣味化合物的結合能力越強。

1.8 數據分析

采用 2-ΔΔCT的方法檢驗OBP14在不同樣本間的表達差異，采用單因素ANOVA法進行方差分析，Duncan氏多重比較法分析差異顯著性(P<0.01表示差異極顯著)。使用GraphPad Prism 7.0軟件對qRT-PCR和熒光競爭結合實驗的數據進行分析和作圖。

2 結果

2.1 OBP14在中蜂和意蜂不同觸角樣本中的表達

利用 qRT-PCR 測定了OBP14在中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日齡中蜂成年工蜂和20日齡中蜂成年雄蜂觸角中mRNA的表達量(圖1)。結果顯示，OBP14在4種觸角樣本中均有表達，但在中蜂采粉蜂觸角中的表達量最高，其次為在20日齡中蜂成年工蜂、20日齡中蜂成年雄蜂中的，均顯著高于在意蜂采粉蜂觸角中的表達量(P<0.01)。

圖1 OBP14在中蜂和意蜂不同觸角樣本中的表達量

2.2 AcerOBP14重組蛋白的誘導表達及純化

重組質粒pET28a/AcerOBP14轉入表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)，經 IPTG 誘導出目的蛋白。實驗中確定最佳誘導溫度為28℃，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白主要以包涵體形式表達，通過尿素變性、純化及透析復性后用凝血酶切除 His-tag 標簽，對切除標簽后的蛋白再次純化，在約14 kD處出現預期的單一條帶(圖2: 泳道11)，條帶清晰均一，可用于熒光競爭結合實驗。

圖2 AcerOBP14重組蛋白 SDS-PAGE 分析

2.3 AcerOBP14重組蛋白濃度

采用Bradford蛋白濃度測定法測定了去除 His-tag 標簽AcerOBP14的濃度，建立標準曲線，標準曲線方程為：y=0.9916x+0.381(R2=0.9963)。經計算， 用于熒光競爭結合實驗的重組蛋白樣品AcerOBP14的濃度為 0.784 mg/mL。

2.4 AcerOBP14重組蛋白與氣味化合物的結合能力

圖3 1-NPN 與重組蛋白AcerOBP14的結合分析

通過Scachard方程對AcerOBP14與1-NPN的結合曲線進行線性化處理，計算出該蛋白與 1-NPN的解離常數為1.087 μmol/L(圖3)。采用熒光競爭結合實驗測定AcerOBP14重組蛋白與37種氣味化合物的結合能力，結果(圖4和表1)顯示，AcerOBP14重組蛋白可以與測試的蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多種植物揮發物結合，與植物揮發物β-羅勒烯的結合能力最強(解離常數 Ki=0.297 μmol/L)，其次是與α-法尼烯(解離常數Ki=0.654 μmol/L)，與其他氣味化合物也有較強的結合能力(Ki<10 μmol/L)，與肉桂酸乙酯和香草醇幾乎沒有結合能力(Ki>50 μmol/L)，而與5種幼蟲信息素組分(棕櫚酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯和亞麻酸甲酯)沒有結合能力。

圖4 部分候選配體與1-NPN 和重組蛋白AcerOBP14的競爭結合

3 討論

本研究結果顯示，OBP14 mRNA在中蜂采粉蜂觸角中的表達量極顯著高于意大利蜜蜂采粉蜂觸角中的，推測OBP14在中蜂的嗅覺行為中發揮著更重要作用，但由于目前尚缺乏中蜂和意蜂觸角中的其他氣味結合蛋白時空表達特性的比較研究，因此有關中蜂較意蜂嗅覺更靈敏的這一認識仍有待進一步證實。20日齡成年工蜂，除承擔巢內工作外，還從事采粉、采蜜、采水、采膠、守衛等巢外工作(Graham, 2015)。本實驗結果顯示中蜂采粉蜂觸角中OBP14 mRNA表達量極顯著高于20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達量，暗示AcerOBP14主要在識別花香氣味上發揮作用，尤其在花粉采集上具有重要作用。AcerOBP14基因在20日齡中蜂成年雄蜂觸角中也有表達，但極顯著低于在中蜂采粉蜂和20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達量(圖1)，進一步推測AcerOBP14可能主要參與調控中蜂的采集行為，另外在雄蜂性信息素感知過程中也發揮作用。

表1 候選氣味化合物與 1-NPN競爭結合重組蛋白AcerOBP14的結合特性

通過對AcerOBP14體外原核表達，發現重組蛋白主要以包涵體的形式存在，形成包涵體可能與pET28a 表達載體本身高表達性質有關。因為，一方面蛋白表達量越高越容易形成包涵體，蛋白合成的速度太快，沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確地配對(吉挺等, 2014)；另一方面，原核表達系統中缺失促使蛋白正確折疊的各種影響因子(程小娟等, 2016)。實驗得到的包涵體需要經過純化、變性、復性后才能具有生理活性，目的蛋白才能用于后續功能的研究。

熒光競爭結合實驗已應用于棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、銅綠麗金龜Anomalacorpulenta、綠盲蝽Apolyguslucorμm、小菜蛾Plutellaxylostella、斑翅果蠅Drosophilasuzukii等多種昆蟲氣味結合蛋白的結合特性分析(程小娟等, 2016; 李都等, 2019; 彭竹等, 2020)。本研究的熒光競爭結合實驗結果表明， AcerOBP14能夠與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素以及植物揮發物等多種氣味化合物結合(表1)，表明一個基因可能調控昆蟲對多種揮發物的識別(Sunetal., 2019)。在測試的氣味化合物中，與AcerOBP14結合能力最強的是植物揮發物β-羅勒烯，其次是α-法尼烯。結合qRT-PCR分析結果，我們推測AcerOBP14在中華蜜蜂識別植物氣味的過程中，即在其外出采集過程中發揮著重要作用。植物揮發物β-羅勒烯是蘭科石斛花朵中的重要成分，石斛花為蟲媒花，其花香在蜂蝶類授粉中發揮著重要的作用，另外β-羅勒烯作為植物揮發物對采集蜂的采粉行為有直接影響(Maetal., 2015; 張智博等, 2018; 王元成等, 2020)。近年來，研究人員還發現β-羅勒烯也是一種蜜蜂幼蟲信息素組分，能夠抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，并且參與調節工蜂的采粉行為，提高采粉蜂的比例，增加哺育蜂訪問巢房的頻率(何旭江等, 2016; 張智博等, 2018)。He等(2016)還發現饑餓的蜜蜂幼蟲通過增加β-羅勒烯的產量向工蜂發出信號，故工蜂可以通過識別這一信息素信號來調節群內的食物分配。本研究結果表明，AcerOBP14與β-羅勒烯的結合能力極強，因此推測其可能具有參與工蜂的采粉及監控群內幼蟲進食等行為。AcerOBP14與大部分幼蟲信息素不能有效結合，這可能與氣味結合蛋白選擇性綁定氣味分子這一生理功能相符(顏偉玉等, 2009; Manoharanetal., 2013)。Spinelli等(2012)研究了意大利蜜蜂OBP14的氣味化合物結合特性，結果表明，AmelOBP14與丁香酚、檸檬腈的結合能力最強，在同其他氣味化合物的結合能力的強弱上，與AcerOBP14 也有差異，可以看出中蜂和意蜂在結合特性上差異較大(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)，推測OBP14的功能可能存在較大的種間差異。今后可以通過免疫印跡、觸角電位(electroantennogram, EAG)、行為學反應和RNAi等實驗進一步比較、確證兩蜂種OBP14的功能。

本研究qRT-PCR結果表明，氣味結合蛋白OBP14基因在中蜂采粉蜂觸角中的相對表達量高于意蜂采粉蜂及中蜂20日齡成年工蜂和雄蜂觸角中的表達量。熒光競爭結合實驗結果顯示AcerOBP14的配體結合譜較寬，能與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多種植物揮發物結合，其中結合能力最強的是β-羅勒烯，暗示AcerOBP14較大程度上參與和調控了中華蜜蜂的采粉行為。