管氏腫腿蜂毒液絲氨酸蛋白酶同源物SgSPH對寄主血淋巴酚氧化酶活性的影響

李麗芳, 吳朝妍, 韓開健, 吳國星, 朱家穎,*

(1. 西南林業大學, 云南省森林災害預警與控制重點實驗室, 昆明 650224;2. 云南農業大學植物保護學院, 昆明 650201)

毒液作為寄生蜂的關鍵寄生因子之一，具有調控寄主生長發育、抑制寄主免疫反應、影響寄主營養代謝等生理功能，在寄生蜂與寄主互作中起重要作用(Kim-Joetal., 2019)。因寄生蜂毒液具有特殊的生理功能，可作為理想的資源用于發掘抗蟲基因，用于新型殺蟲制劑或轉基因抗蟲植物的研發(Beckage and Gelman, 2004; Danneelsetal., 2010)。而且，系統研究寄生蜂毒液蛋白功能，有助于深入揭示寄生蜂調控寄主的機制。雖然目前已就隸屬繭蜂科(Brcaoindae)、姬蜂科(Ichneumonidae)、金小蜂科(Pteromalidae)等近10個科的20多種寄生蜂毒液組分進行鑒定，獲得了豐富多樣的上百種毒液蛋白，但是僅探明了鈣網蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑和RhoGAP等少數毒液蛋白的功能(Poiriéetal., 2014; Moreau and Asgari, 2015; Yanetal., 2017; Liuetal., 2018; Yangetal., 2019; Duetal., 2020)。

為了抵御寄生蜂的寄生，寄主昆蟲會利用高效的免疫系統進行防御反應。血淋巴黑化作為寄主昆蟲重要的體液免疫反應，可伴隨黑色素的形成，產生多種對寄生蜂后代有毒的物質(Clark, 2020)。酚氧化酶(phenoloxidase, PO)是昆蟲體內參與黑化反應的關鍵酶，通常以無活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)形式存在于昆蟲的血淋巴中(Luetal., 2014)。當外源物入侵昆蟲時，會觸發蟲體內以酶原形式存在的絲氨酸蛋白酶(serine protease, SP)被激活，形成具有酶活性的酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidase activating proteinase, PAP)，進而切割PPO變為PO，迅速激活黑化反應(張明明等, 2012; Sugumaran and Barek, 2016; Veillardetal., 2016; Whitten and Coates, 2017)。SP酶活性的發揮是依靠其氨基酸序列內存在的由組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和絲氨酸(S)組成的催化三聯體實現，如果其中某個催化三聯體位點氨基酸殘基發生缺失或突變，其催化功能受影響，將此類蛋白稱為絲氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue, SPH)(Cao and Jiang, 2018)。在昆蟲血淋巴黑化反應過程中，SPH對PO的級聯反應起到重要的調控作用(Kanostetal., 2004; Felf?ldietal., 2011)。為了保證后代的成功發育，寄生蜂需攻克寄主的血淋巴黑化。有關寄生蜂毒液表觀生理功能研究表明，它普遍具有抑制寄主血淋巴黑化的作用(Beckage and Gelman, 2004; 劉奎等, 2008; Becchimanzietal., 2017; Cusumanoetal., 2018)。

縱觀有關寄生蜂毒液蛋白組分鑒定的研究結果可知，SP/SPH是寄生蜂毒液中普遍存在的蛋白組分，且通常作為高豐度蛋白存在(Poiriéetal., 2014; Zhu, 2016; Yeetal., 2020)?；赟P/SPH在昆蟲血淋巴黑化反應中的重要作用，提示寄生蜂毒液SP/SPH應具有參與調控寄主昆蟲血淋巴黑化的功能。然而，迄今有關寄生蜂毒液SP/SPH的功能研究甚少，僅探明了微紅盤絨繭蜂Cotesiarubecula毒液Vn50(SPH)以及管氏腫腿蜂Sclerodermaguani毒液Vn7(SPH)具有抑制寄主血淋巴黑化的功能，更多寄生蜂毒液SPH的功能有待被揭示(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)。有鑒于此，本研究對另外一個管氏腫蜂毒液SPH基因SgSPH進行克隆表達，并分析其對寄主黃粉蟲Tenebriomolitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的影響。本研究結果將有助于理解和深入研究揭示管氏腫腿蜂毒液抑制寄主血淋巴黑化的內在機制。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

管氏腫腿蜂為實驗室繼代飼養種群，采用黃粉蟲蛹為寄主進行繁育，不定期采集野外蜂種進行復壯(Zhuetal., 2013)。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Trizol試劑(Invitrogen)，參照試劑說明書，從約35頭管氏腫腿蜂成蟲中提取總RNA?？俁NA經分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測，質量合格后，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)將其反轉錄合成cDNA模板。根據實驗室前期從管氏腫腿蜂毒液器官轉錄組中獲得的SPH基因序列(Zhu, 2016)，設計上游引物5′-ACGCCATATACAGTGCAACGT-3′和下游引物5′-TAGGAACCTCTGTTACCATATCT-3′，克隆毒液SgSPH基因的ORF序列。PCR反應體系(25 μL): cDNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTP Mixture 12.5 μL, 超純水9.5 μL。PCR反應條件: 94℃預變性30 s; 94℃變性30 s, 60℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 35個循環; 72℃10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒進行回收純化，克隆到pGEM?-T-easy載體(Promega)，藍白斑篩選，挑取陽性克隆送至上海杰李生物技術有限公司進行測序。用SignalP 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對信號肽進行預測，氨基酸多序列比對采用Mafft v7.311軟件的L-INS-i算法(Katoh and Standley, 2013)。

1.3 qPCR檢測基因表達

分別收集管氏腫腿蜂不同發育階段(卵、低齡幼蟲、高齡幼蟲、老熟幼蟲、吐絲幼蟲、黃繭蛹、黑繭蛹和羽化后1-5 d成蟲)和解剖雌成蟲不同組織(頭部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)樣品于Trizol試劑中，研磨后保存于-80℃冰箱備用。參照試劑說明書，提取各樣品總RNA，經DNAase處理去除其中的基因組DNA后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄獲得cDNA模板。根據管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列設計引物(F: 5′-AATACGCCATATACAGTGCAA CGT-3′和R: 5′-GCAATCAGCAAGAGTCAAAAGAAA-3′)，分別以18S RNA(F: 5′-TGGGCCGGTACGTTTA CTTT-3′和R: 5′-CACCTCTAACGTCGCAATAC-3′)和5.8S RNA(F: 5′-AAGAGCGACGCCAAACC-3′和R: 5′-ATG GGTCACTCGACTGGAT-3′)基因作為不同發育階段和不同組織樣品中基因表達量檢測的內參基因，采用兩步法擴增檢測SgSPH基因的相對表達量，每個樣品生物學重復3次，每個生物學重復至少來自5頭管氏腫腿蜂。qPCR反應體系: SYBR? Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 8.5 μL。qPCR反應程序: 95℃預變性30 s; 95℃變性5 s, 58℃退火40 s, 45個循環。

1.4 基因原核表達及Western blot檢測

在管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因ORF框兩側設計帶有StuI和HindIII酶切位點的正向引物5′-AGGCCTACGCCATATACAGTGCAACGT-3′(下劃線為StuI酶切位點)和反向引物5′-AAGCTTTA-GGAACCTCTGTTACCATATCT-3′(下劃線為HindIII酶切位點)，以1.2節中合成的cDNA為模板進行PCR擴增。純化的PCR產物，采用StuI和HindIII進行雙酶切，酶切產物經切膠純化后在T4 DNA連接酶的作用下于4℃與帶Sumo標簽的質粒pSUMO-Mut載體(南京鐘鼎生物技術有限公司)連接過夜，獲得重組質粒。隨后，將重組質粒傳化至大腸桿菌EscherichiacoliTOP10感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證。

將驗證無誤的重組質粒轉化至Arctic Express宿主菌，挑取單克隆接種于含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB(Luria Broth)培養液中，于11℃ 220 r/min下培養，使用IPTG(0.5 mmol/L)進行誘導表達。將誘導表達后的培養菌液于低溫6 000 g離心10 min后棄上清，用20 mL裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L PMSF， pH 8.0)重懸菌體沉淀，并對沉淀進行超聲波破碎后，于4℃ 10 000 g離心20 min后棄上清。然后，用緩沖液(20 mmol/L Tris, 5 mmol/L DTT, 8 mol/L尿素，pH 8.0)溶解包涵體，4℃過夜后15 000 g離心15 min取沉淀，并用包涵體洗滌液(20 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 2 mol/L尿素, 1 mol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 8.0)洗滌3次，再進行超聲破碎。最后，使用Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化復性的基因表達產物，使用酶將其SUMO表達標簽切除后，再次進行親和純化?；虮磉_情況和切除標簽后的基因表達產物純度使用12% SDS-PAGE電泳進行檢測。

SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質轉印到PVDF膜上，用清洗液(PBS-Tween Buffer)進行洗滌之后，用5%的脫脂奶粉溶液于室溫下將PVDF膜封閉2 h，然后37℃條件下與SUMO抗體溶液孵育1 h，再用清洗液漂洗3次。接著放入經5%脫脂奶粉溶液稀釋的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1 h。最后，在洗液中漂洗3次后，用DAB顯色后拍照，進行Western blot檢測。

1.5 酚氧化酶活性測定

收集化蛹24 h的黃粉蟲蛹血淋巴于無菌的1.5 mL離心管中，于4℃ 3 000 g離心10 min 去除血細胞，獲得寄主血漿。迅速取6 μL寄主血漿于離心管中，接著往離心管中加入6 μL PBS，0.25和0.50 μg的純化且切除表達標簽的SgSPH重組蛋白，混勻后室溫反應15 min。同時，分別以磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)和丙基硫尿嘧啶(propylthiouracil, PTU)作為陰性和陽性對照。每個處理生物學重復3次，每個生物學重復來自10頭黃粉蟲蛹血淋巴。反應結束后，從各離心管中分別取4 μL混合液加入96孔酶標板中，分別加入10 μL PBS和180 μL 0.01 mol/L的L-DOPA(Sigma)作為酶底物混勻，于15 min后490 nm處測定樣品OD值。

1.6 數據分析

qPCR數據采用2-ΔΔCT法進行計算(Livak and Schmittgen, 2001)。 所有統計分析采用SPSS 17.0軟件進行，采用Fisher’s least significant difference(LSD)法分析不同樣本中管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的相對表達量以及不同處理間寄主黃粉蟲蛹血淋巴酚氧化酶活性OD值的差異顯著性。顯著性水平均為P<0.05。 采用GraphPad Prism 7軟件(GraphPad Software Inc.)制圖。

2 結果

2.1 SgSPH基因克隆及序列特征

克隆獲得的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登錄號: MT920663)的ORF長為798 bp，編碼265個氨基酸，其中第1-20位氨基酸預測為信號肽。該基因編碼氨基酸序列的理論分子量為30.53 kD，等電點為9.59。多序列比對分析發現，SgSPH與蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、微紅盤絨繭蜂、黃痣黑瘤姬蜂Pimplahypochondriaca、阿爾蚜繭蜂Aphidiuservi以及麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis毒液SP/SPH的氨基酸序列一致性在9%～17%之間。而且，三聯體酶催化活性中心(Asp, His和Ser)的氨基酸殘基在SgSPH氨基酸序列中發生了突變，其中組氨酸(His)變為天冬氨酸(Asp)，天冬氨酸(Asp)變為天冬酰胺(Asn)，絲氨酸(Ser)突變為異亮氨酸(Ile)，具有由6個保守的半胱氨酸殘基組成的3對二硫鍵(圖1)。

2.2 SgSPH基因表達特征

qPCR結果顯示，管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因在卵、幼蟲、蛹中低表達或幾乎不表達，成蟲羽化后開始表達，表達量逐漸增加，到羽化5 d時表達量最高(圖2: A)，該毒液基因在成蟲階段的表達量，與在其他發育階段的表達量相比差異顯著(P<0.05)；在毒液器官中高表達，在頭部、胸部和去除毒液器官的腹部中表達量較低(圖2: B)。

圖1 管氏腫腿蜂毒液SgSPH與其他寄生蜂毒液SP/SPH蛋白多序列比對

圖2 管氏腫腿蜂不同發育階段(A)和雌成蟲不同組織中(B)毒液SgSPH基因的表達分析

2.3 SgSPH基因原核表達及純化

利用表達載體pSUMO-Mut對管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因進行原核表達，表達產物經SDS-PAGE電泳檢測，發現該基因低溫條件下可被IPTG誘導表達，且主要在包涵體中表達(圖3)。對包涵體中的表達蛋白進行復性處理、親和純化及SUMO標簽酶切，SDS-PAGE電泳和Western blot檢測發現，SUMO標簽切除前后純化的基因表達產物純度均高。SUMO標簽切除后的重組表達蛋白分子量約30 kD，這與預測的理論分子量吻合。這些結果表明，成功表達并純化獲得了管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白，且其純度滿足后續功能研究。

圖3 管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的原核表達及蛋白純化

2.4 SgSPH對寄主血淋巴酚氧化酶活性的影響

以L-DOPA為底物，測定分析復性后的管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白對寄主黃粉蟲蛹血淋巴中的酚氧化酶活性的影響。結果如圖4所示，經酚氧化酶抑制劑PTU處理的血淋巴酚氧化酶活性明顯受到抑制。經PBS和0.25 μg SgSPH處理的血淋巴酚氧化酶活性間無顯著差異(P>0.05)，但經0.50 μg SgSPH處理的血淋巴酚氧化酶活性顯著低于經PBS和0.25 μg SgSPH處理的(P<0.05)，且與經PTU處理的血淋巴酚氧化酶活性間無顯著差異(P>0.05)，表明較高劑量下的管氏腫腿蜂毒液SgSPH能抑制寄主血淋巴黑化。

圖4 管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白對寄主黃粉蟲蛹血淋巴中酚氧化酶活性的影響

3 討論

本研究基于前期管氏腫腿蜂毒液器官轉錄組中鑒定到的基因序列，采用RT-PCR方法克隆獲得了管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列。序列分析表明，該基因編碼的氨基酸序列中存在信號肽序列，說明它是可以分泌的毒液蛋白，具備典型毒液蛋白的分泌特征(Moreau and Asgari, 2015)。與其他昆蟲SP/SPH具有二硫鍵結構一樣，克隆得到的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因編碼的氨基酸序列內也存在形成二硫鍵的保守半胱氨酸殘基(Veillardetal., 2016)。就保守的SP催化三聯體殘基而言，和已報道的微紅盤絨繭蜂毒液Vn50和管氏腫腿蜂毒液Vn7(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)相似，本研究克隆得到的毒液SgSPH基因編碼蛋白氨基酸序列的催化三聯體氨基酸位點發生了突變或缺失。序列分析結果不僅表明此處克隆獲得的毒液基因確實為SPH成員，而且提示該毒液蛋白不具有蛋白水解酶活性。

有關寄生蜂毒液蛋白組分的鑒定結果表明，SP/SPH通常在寄生蜂毒液中大量存在(Poiriéetal., 2014)。如，SP/SPH是麗蠅蛹集金小蜂毒液中最具代表性的成分，并在蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、中紅側溝繭蜂Microplitismediator、蠅蛹金小蜂Pachycrepoideusvindemmiae等毒液中大量存在(de Graafetal., 2010; Yanetal., 2017; Linetal., 2019; Yangetal., 2020)。此外，對管氏腫腿蜂毒液蛋白進行鑒定，也證實SP/SPH為該蜂毒液的高豐度組分(Zhu, 2016)。SP/SPH作為寄生蜂的高豐度毒液蛋白，它們會在毒液器官中高表達(Becchimanzietal., 2020)。qPCR分析結果表明，本研究克隆獲得的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因在毒液器官中高表達，在雌成蟲其他組織中也有表達(圖2: B)。目前，寄生蜂毒液SPH基因的表達調控機制尚不清楚，在毒液器官中高表達的調控機制值得后續深入研究。此外，基因表達特征結果顯示，在不同發育階段，管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的轉錄水平從黑繭蛹開始升高，到羽化后5 d的成蟲中表達量最大(圖2: A)，其表達模式與寄生蜂毒液器官的發育相符合，同時也提示其可能參與蟲體變黑和變態發育等過程(Liuetal., 2018; Wuetal., 2020)。

酚氧化酶是昆蟲血淋巴黑化中的關鍵酶，其活性高低可以反映昆蟲通過血淋巴黑化防御外來物入侵的強度(Whitten and Coates, 2017)。寄生蜂為了保證后代的成功發育，需要有效地抑制寄主昆蟲血淋巴黑化反應產生的有害物質對其后代造成傷害(Beckage and Gelman, 2004; Kim-Joetal., 2019)。前期研究發現，管氏腫腿蜂寄生能抑制寄主黃粉蟲蛹血淋巴黑化(Wuetal., 2020)。通過酶活性測定發現，0.50 μg劑量下的重組表達蛋白SgSPH能抑制寄主黃粉蟲蛹血淋巴中的酚氧化酶活性(圖4)，表明SgSPH具有抑制寄主血淋巴黑化的功能。目前，已有數種具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白被鑒定，且它們是通過干擾酚氧化酶級聯反應實現其生理功能(錢岑等, 2013; Wuetal., 2020)。如，布拉迪小環腹癭蜂Leptopilinaboulardi毒液中的LbSPNy能明顯地抑制寄主體內原酚氧化酶級聯系統的激活(Colinetetal., 2009)；微紅絨繭蜂毒液中的Vn50通過與寄主酚氧化酶級聯系統中的SPH競爭，從而抑制寄主血淋巴的黑化(Thomas and Asgari, 2011)；蝶蛹金小蜂毒液中的絲氨酸蛋白酶抑制劑PpS1V通過以寄主血淋巴中的PAP蛋白酶形成復合物來抑制原酚氧化酶的激活，進而抑制寄主血淋巴黑化(Yanetal., 2017)。據此認為，本研究報道的管氏腫腿蜂SgSPH可能與上述其他具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白作用機制相似，是通過干擾寄主酚氧化酶級聯反應發揮抑制寄主血淋巴黑化的功能，其內在機制有待進一步研究。