β2-腎上腺素受體色譜模型的建立及在止咳平喘藥篩選中的應(yīng)用

＊尚叢珊 侯亞妮

（西安培華學(xué)院 陜西 710025）

隨著社會(huì)快速發(fā)展，空氣質(zhì)量與日下降，呼吸系統(tǒng)疾病尤其是支氣管哮喘，發(fā)病率逐漸上升。支氣管哮喘的防治指南中明確指出，控制哮喘發(fā)作是治療支氣管的主要目的[1]。臨床治療藥物包括β2-AR激動(dòng)劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿類(lèi)和抗膽堿類(lèi)藥物等，其中β2-AR激動(dòng)劑能與呼吸系統(tǒng)平滑肌上的β2-AR結(jié)合，消除氣管痙攣，被廣泛用于治療急性支氣管哮喘。但是，現(xiàn)有治療方法中激素類(lèi)藥物使用較多，存在不良反應(yīng)大、費(fèi)用高等問(wèn)題。

中藥在我國(guó)具有歷史悠久，療效顯著、副反應(yīng)小且資源豐富的特點(diǎn)，利用價(jià)值較高，已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)高效創(chuàng)新藥物的主要選擇，但是其成分復(fù)雜，臨床用藥辯證靈活，因此，活性成分篩選成為藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素[2]，中藥活性成分篩選也是藥學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

β2-腎上腺素受體（β2-AR）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，分布于平滑肌中，能夠與兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)或受體激動(dòng)劑、拮抗劑相作用，引起舒張血管、松弛平滑肌、擴(kuò)張支氣管、分解肝糖元等一系列生理反應(yīng)[3-4]。肺部β2-AR接受刺激可引起氣道平滑肌放松，常被作為止咳平喘藥發(fā)揮作用的主要靶受體[5]。本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，將受體與藥物作用的特異性和色譜技術(shù)相結(jié)合，建立β2-腎上腺素受體色譜模型，研究其在止咳平喘藥活性成分篩選中的應(yīng)用。

1.腎上腺素受體

受體因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在生物學(xué)檢測(cè)和藥物篩選等方面逐漸被重視，腎上腺素受體（AR）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，包括α-腎上腺素受體和β-腎上腺素受體（α-AR和β-AR）[6]。隨著對(duì)腎上腺素受體的深入研究，人們又發(fā)現(xiàn)不同腎上腺素受體的解剖定位和功能特性在機(jī)體內(nèi)各有差異，分布于平滑肌組織和肺組織的β2-AR對(duì)腎上腺素的敏感性更高[7-8]，可以介導(dǎo)血管和平滑肌的擴(kuò)張，分布于脂肪細(xì)胞的β3-AR對(duì)調(diào)節(jié)釋放瘦蛋白起重要作用[9]。

(1)β2-腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)

β2-AR分子量約64KD，有3個(gè)糖基化位點(diǎn)和2個(gè)額外的螺旋肽，7次跨膜結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)螺旋折疊形成“口袋”狀配基結(jié)合位點(diǎn)。靠近胞外環(huán)的跨膜和第二胞外環(huán)處是藥物的主要結(jié)合位點(diǎn)[10]，靠近胞內(nèi)的跨膜氨基酸和胞內(nèi)環(huán)可結(jié)合G蛋白并參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。細(xì)胞膜上β2-AR以單體或者二聚體形式動(dòng)態(tài)平衡地存在，表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，與膜上蛋白結(jié)合位點(diǎn)相互作用，單體形式即能保證功能發(fā)揮，與配體以1:1結(jié)合[12]。

(2)β2-腎上腺素受體的功能

β2-AR依靠偶聯(lián)蛋白（G蛋白）和腺苷酸環(huán)化酶（AC）聯(lián)合作用發(fā)揮效應(yīng)，兒茶酚胺類(lèi)與受體作用后，激活G蛋白，并將信息傳遞給效應(yīng)器腺苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生CAMP。β2-AR與G蛋白偶練位點(diǎn)主要位于其跨膜域中，與激動(dòng)劑連接后腺苷酸環(huán)化酶即被激活，使CAMP濃度升高，誘發(fā)一系列生化反應(yīng)，從而發(fā)揮生理效應(yīng)。

2.β2-腎上腺素受體分離純化的研究

建立受體色譜模型中，獲得高純度的受體是構(gòu)建模型的基礎(chǔ)。目前獲得β2-AR的方法主要包括真核、原核細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行蛋白的分離純化具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、純化效果好的特點(diǎn)，且蛋白的生物活性不受影響。本實(shí)驗(yàn)主要采用原核細(xì)胞表達(dá)，將人源β2-AR目的基因重組至環(huán)狀質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得目的菌并純培養(yǎng)，收獲菌體細(xì)胞，超聲破碎，獲得含β2-AR的上清液，經(jīng)親和層析和陰離子交換柱，收集純化蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺-考馬斯亮藍(lán)鑒定所得蛋白即為目的蛋白。

3.β2-腎上腺素受體色譜模型的建立

(1)生物色譜法

傳統(tǒng)β2-AR色譜法是指將特定的受體固定于載體上，用常規(guī)分析方法挑選試劑。而出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代中后期的生物色譜法則是將色譜分離技術(shù)和生命科學(xué)結(jié)合起來(lái)，利用藥物通常與靶點(diǎn)即生物大分子包括酶、受體、通道蛋白等結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)的原理[13]。采用細(xì)胞膜、酶、仿生物膜等生物活性材料做固定相，能與各種生物活性物質(zhì)特異性結(jié)合，應(yīng)用于藥物活性成分的篩選和藥理研究，使藥物有效成分的分離與篩選相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分-效應(yīng)-作用機(jī)理聯(lián)動(dòng)的藥物研究新方法，尤其適合天然藥物的研究。

生物色譜法將活性生物大分子、細(xì)胞膜等鍵合于色譜載體上，根據(jù)固定相不同，該法可分為分子生物色譜法、生物膜色譜法、仿生物膜色譜法和細(xì)胞生物色譜法等[14]。該實(shí)驗(yàn)中采用的則是較為成熟的分子生物色譜法。

(2)β2-腎上腺素受體色譜

β2-AR色譜以受體作為配基，依靠其特異性進(jìn)行藥物活性成分研究，可實(shí)現(xiàn)中藥活性成分篩選、分離和結(jié)構(gòu)鑒定一體化分析，具有穩(wěn)定性高、靈敏性高的特點(diǎn)。相比于傳統(tǒng)色譜技術(shù)，受體色譜載體固定方式特定，可較好地確保實(shí)驗(yàn)效果，且使用的載體為硅膠，穩(wěn)定性較好，可重復(fù)利用，其次，該方法能優(yōu)化和調(diào)節(jié)固定受體的方向和構(gòu)象，可最大化實(shí)現(xiàn)受體-藥物相互作用，可用于中藥復(fù)雜成分的高效靶向篩選和快速分析[15]。

基于該優(yōu)勢(shì)，利用本實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)制備氨丙基硅膠作為載體，并將純化所得的β2-AR鍵合于該載體，采用濕法填裝色譜柱，所得即為β2-腎上腺素受體色譜模型。經(jīng)工具藥硫酸沙丁胺醇、酚妥拉明、普萘洛爾等工具藥進(jìn)行保留特性研究，證明該β2-AR色譜模型生物活性、穩(wěn)定性和特異性均良好，可用于研究受體與藥物的相互作用及篩選中藥藥物活性成分。

4.β2-腎上腺素受體色譜模型在止咳平喘藥活性成分篩選中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)止咳平喘多以黃芩、桑白皮、麻黃、杏仁等藥作為優(yōu)選中藥。黃芩主入肺經(jīng)，善清瀉肺火，多用于治療肺熱咳嗽氣喘、痰稠痰多；桑白皮清熱瀉肺，用于治療伏火郁肺，肺熱喘逆，肝火犯肺等癥；麻黃主入肺經(jīng)，宣肺止咳平喘，同時(shí)還可防寒氣太過(guò)；杏仁具有止咳平喘、降氣的功效，這些均是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在治療呼吸系統(tǒng)疾病中可發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，將以上中藥作為對(duì)象，實(shí)驗(yàn)室水煎提取，制備濃縮藥液，利用β2-腎上腺素受體色譜模型進(jìn)一步驗(yàn)證藥物中的有效成分。在擬定色譜條件下進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)黃芩、麻黃、杏仁提取液在β2-腎上腺素受體色譜柱上均有色譜保留峰出現(xiàn)，表明其含有可與β2-AR相作用的活性成分。

5.結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)腎上腺素受體及β2-AR結(jié)構(gòu)的分析，了解其主要功能。利用基因重組技術(shù)獲得β2-AR，結(jié)合生物色譜法的構(gòu)建原理，建立β2-腎上腺素受體色譜模型，并驗(yàn)證該模型生物活性、穩(wěn)定性和特異性。利用該模型對(duì)黃芩、桑白皮、麻黃、杏仁等藥物中藥效成分進(jìn)行初步驗(yàn)證，結(jié)果表明，黃芩、麻黃、杏仁中含有可與β2-AR相作用的成分，該模型能夠在中藥活性成分篩選中發(fā)揮一定作用，為接下來(lái)藥效成分的篩選鑒定提供參考價(jià)值。