熱原檢查中家兔注射細菌內毒素后的升溫情況考察

李楊，張曉杰，尹敏，王立增，曹大偉，鄭霞

1.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000；2.泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000

熱原是能引起恒溫動物產生異常升溫情況的致熱物質的總稱。熱原在注射入人體后可能會引起寒戰、發燒、嘔吐等情況，甚至會威脅生命，熱原檢查對于靜脈注射類藥品質量的控制尤為關鍵。藥典規定的熱原檢查法是家兔法熱原檢查和細菌內毒素檢查法熱原檢查。家兔法熱原檢查是將一定劑量的待檢藥品通過家兔靜脈注射入家兔體內，通過家兔體溫變化情況判定檢測藥品中是否含有熱原，家兔具有與人類相似的發熱機理［1］，并且與能引起人類發熱的最小細菌內毒素的劑量基本一致。家兔法熱原檢查反映出的各種熱原在機體中的表現與臨床反應相近，適用于檢查較多種類的熱原物質，是我國藥品和生物制品質量評價中常用的熱原檢查方法［2］。細菌內毒素是藥品生產中最常見、危害最大的一類熱原物質，也是熱原檢查的主要目標。鱟試劑法僅能檢測細菌內毒素，不能檢測其他種類的熱原［3］。本研究將不同劑量的細菌內毒素注射入家兔靜脈，統計家兔的升溫情況，考察內毒素劑量與家兔升溫之間的關系，提高試驗的準確性與可靠性。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

電熱恒溫鼓風干燥箱（山東濰坊精鷹醫療器械有限公司，型號：立鶴牌 502 型），低壓漩渦攪拌機（賽默飛世爾科技有限公司，型號：G8KT18057），微機熱原測定儀（上海遼卓科貿有限公司，型號：WRY-2015 型），熱原測定程序（上海遼卓科貿有限公司，型號：Pyrogen Test Expert 2015），10 mL 注射器（山東新華醫療器械股份有限公司，批號：190615）。

1.2 實驗試劑

細菌內毒素工作標準品（湛江安度斯生物有限公司，規格：10 EU/支，批號：1905311），細菌內毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，規格：5 mL/支，批號：1904250），氯化鈉注射液（0.9%生理鹽水，重慶三大偉業制藥有限公司，批號：20190831）。

1.3 實驗用家兔

普通級家兔24 只，品種為新西蘭大白兔，體質量1.7～3.0 kg，實驗動物生產許可證：SCXK（魯）2018-0001，實驗動物使用許可：SYXK（魯）2018-0001，飼養條件：溫度17～25 ℃，濕度40～70%。家兔按照《中國藥典》2015 版通則中熱原檢查法進行預選。

1.4 器材準備

基于本公司驗證的除熱原程序，將安瓿瓶用錫箔紙包住，置于電熱恒溫鼓風干燥箱中，240 ℃，干烤2 h，除去熱原。

1.5 細菌內毒素供試液制備

取10 EU/支的細菌內毒素工作標準品15 支，分別用1 mL 細菌內毒素檢查用水復溶，封口膜包好，置于旋渦震蕩儀上震蕩15 min，用0.9%氯化鈉注射液將內毒素配成0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL 的溶液，按家兔體質量每1 kg 注射1 mL，即家兔內毒素注射劑量分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 EU/mL 的內毒素供試液。

1.6 熱原檢查家兔法

1.6.1 家兔預選 選擇1.7～3.0 kg 的新西蘭大白兔，健康無異常。預測體溫前7 d 用同一批飼料喂養，在此期間，體質量無減輕，精神、食欲、排泄等無異常情況。本次試驗是采用未經任何試驗的家兔，按照《中華人民共和國藥典》通則1142［4］，每隔30 min 測溫1 次，共測溫8 次。選用家兔體溫均在38.0～39.6 ℃之間，且溫差不超過0.4 ℃的家兔。

1.6.2 試驗步驟 24 只家兔分為8 組，每組3 只，分別將0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL的溶液，按家兔體質量每1 kg 注射1 mL，每個劑量注射3 只家兔，生理鹽水作為空白對照組，同樣每1 kg 家兔注射1 mL，注射3 只家兔，注射后每30 min 測溫一次，共測溫6 次，觀察注射后3 h 家兔的升溫情況。按照《中華人民共和國藥典》通則1142［4］進行結果判定。

2 結果

空白對照（CK）組，0.25 EU/kg 組和0.5 EU/kg組溫度比較平穩，基本無升溫現象。1 EU/kg 組的家兔，三只家兔溫度稍有波動，但個體升溫和升溫總和均符合藥典規定。2 EU/kg 組的家兔，有一只家兔升溫超過0.6 ℃。2.5 EU/kg 組的家兔，有一只家兔升溫超過0.6 ℃，升溫總和超過1.3 ℃。5 EU/kg 組的家兔，2 只家兔升溫超過0.6 ℃，且升溫總和超過1.3 ℃。0.5 EU/kg 至10 EU/kg 的注射劑量存在明顯的劑量關系，見表1、圖1。

圖1 細菌內毒素注射劑量與家兔體溫升溫總和的關系

3 討論

從本次實驗的數據發現，家兔在0.5 EU/kg 的內毒素注射劑量以下，家兔均沒有明顯的升溫現象；內毒素注射劑量在1 EU/kg 及以上時，家兔的體溫有明顯的升高，升溫存在個體差異，在同一注射量下，家兔的升溫差異很大，可達到0.58 ℃。

本次試驗熱原檢查家兔法內毒素靈敏度為大于5 EU/kg，家兔總體均有明顯升溫，內毒素注射劑量與家兔升溫度數存在劑量關系。內毒素注射劑量在家兔升溫閾值之上時，組內家兔至少有2 只升溫超過0.6 ℃。

從本次實驗的結果分析，家兔的個體因素對實驗的影響較大，家兔并不是穩定的化學試劑，不同家兔對內毒素的靈敏度均有差異，實驗室潔凈度，實驗人員的注射手法，家兔的基礎體溫等都對實驗結果有影響［5-6］。因此家兔法檢測熱原的方法，僅能檢測供試品所含熱原是否超過質量標準的限度，不能從家兔的升溫度數確定內毒素的含量。如家兔法熱原檢查初試結果偏高，進行復試后結果仍舊偏高，基本可以排除家兔個體差異的因素，可以從其他方面探究原因。

探究內毒素注射劑量與家兔升溫值之間關系，雖然不能確定內毒素的具體含量，但是能大致推測內毒素含量的區間范圍，對企業藥品質量控制提供了一定的參考依據。實際生產中，若產品熱原檢查結果數值雖符合藥典質量標準，卻呈現較高的趨勢時，應考慮其熱原水平是否較高的可能，并需要引起足夠的重視。

表1 注射不同劑量細菌內毒素后家兔體溫變化

家兔法熱原檢查和細菌內毒素檢查法熱原檢查是目前應用最廣泛的兩種熱原檢查方法，但是有其固有的缺點，相關藥品企業可以采用兩種方法結合檢測藥品中熱原含量是否超過限度，提高藥品質量，維護病人用藥安全。目前，包括全血法、單核細胞系法與人外周血單個核細胞在內的體外熱原檢查法得到了廣泛研究，研究建立單核細胞法代替上述兩種傳統熱原檢測方法是熱原檢測領域發展的整體趨勢［7-8］。

由于現有方法的局限性，我們并不能直接根據家兔的升溫情況判定熱原的含量，隨著人們對熱原物質的不斷認知，發熱機理的進一步認識，生物學技術的發展與應用，以及檢測方法的不斷提高，可能會有靈敏度、準確度更高的方法準確檢測出供試品中熱原的種類與含量，大大提高檢測人員的檢測效率，增加用藥安全。