紫外-可見分光光度計的改造及其在實驗教學中的應用

陳玉清，陳雙雯，姬媛媛

1廈門大學化學國家級實驗教學示范中心，福建 廈門361005

2廈門大學化學化工學院，福建 廈門361005

紫外-可見分光光度計是基于紫外-可見分光光度法原理，利用物質分子對紫外-可見光譜區的輻射吸收來進行分析的一種分析儀器，主要由光源、單色器、吸收池、檢測器和信號處理器等部件組成。1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外-可見分光光度計。此后，紫外-可見分光光度計經不斷改進，又出現自動記錄、自動打印、數字顯示、微機控制等各種類型的儀器，使分光光度法的靈敏度和準確度也不斷提高，應用范圍不斷擴大。紫外-可見分光光度計在環保、農產品和食品分析、植物生化分析、飼料分析等領域應用廣泛[1]。近年來，紫外分光光度計的研究報道依然不少，但主要集中在產品的應用與方法研究[2-14]及檢定維護[15-19]等相關方面，使用者對于儀器應用功能的研究報道極為少見，尤其是儀器改造方面。筆者對實驗室現有紫外分光光度計進行了簡易的改造，拓展了儀器的使用功能，同時，將其與恒流泵和部分收集器聯用，組建新蛋白質部分收集系統，并在實驗教學中加以應用，提高儀器的使用效率。

1 儀器改造的初衷

筆者所在化學生物學教學實驗室屬于專業基礎實驗室，主要承擔化學生物學綜合實驗和生物化學實驗。這兩門實驗課程主要面向化學生物學專業(必修)和學院內其他專業(選修)。蛋白質的分離純化(含鹽析、柱層析等)是生物化學實驗的重要內容之一。蛋白質部分收集系統是蛋白質柱層析的主要設備，該系統主要包括部分收集器、核酸蛋白檢測儀、恒流泵和記錄儀，而相關設備在其他實驗項目中鮮有使用。筆者在多年的實驗室管理中發現國產的核酸蛋白檢測儀和記錄儀經常會因為使用頻率較低等原因導致實驗課中儀器穩定性下降，甚至出現較多的故障。為了解決相關困擾，筆者多年來一直不斷探索相關儀器的可替代設備，并最終將目標鎖定在分光光度計上。

2 可行性分析

實現分光光度計替代核酸蛋白檢測儀和記錄儀主要面臨兩個方面的問題：1) 流動進樣；2) 數據的連續采集與記錄。筆者實驗室現有多種分光光度計(詳見表1)，經過綜合分析，筆者選用島津UV-1750作為首選對象。

表1 實驗室現有分光光度計統計情況

2.1 硬件可行性分析

分光光度計是教學實驗室常見的分析儀器，其數據采集的靈敏度和精度等能夠完全滿足蛋白質部分收集系統的需要。實驗室分光光度計樣品室單元通常通過內置比色皿支架與普通比色皿配合使用進行實驗樣品的分析與測試，不能滿足流動樣品的在線檢測功能，而流動樣品的在線檢測是蛋白質部分收集系統的必要條件。經調研發現，市場上的微量石英流動比色皿可以很好地解決上述問題。

2.2 軟件的可行性分析

島津UV-1750可以使用專用的PC軟件UV Probe，進行數據分析、處理、打印，可顯示光譜數據以及時間過程曲線。通過對軟件的分析，軟件中動力學的時間掃描程序可以實現樣品數據的連續采集與記錄，進而問題轉化為相關參數的設定能否滿足實驗的需要。經過對采集參數的進一步整理與分析(詳見表2)，序號9以前的參數可以滿足普通實驗教學的需要，序號12以前的參數可以滿足多數科研實驗的需要。

表2 采集參數分析

3 紫外-可見分光光度計的改造與應用

3.1 儀器的改造與BSA的檢測

島津UV-1750的改造針對樣品室單元進行，如圖1A所示，采用流動比色皿置于比色皿支架上，流動比色皿上端端口分別連接硅膠管，從樣品室底部小孔經儀器底部從左側或前方出來，一端連接樣品，另一端連接收集裝置。改造后的島津UV-1750可替代核酸蛋白檢測儀和記錄儀應用于傳統的蛋白質部分收集系統，組建成新蛋白質部分收集系統，如圖1B所示。

3.2 BSA的初步檢測

新蛋白質部分收集系統用于牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)初步分析，實驗分析條件：層析柱內徑16 mm、高400 mm，填料為Sephadex G-100，洗脫液為磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)，BSA 濃度 4 mg·mL?1，上樣量 1 mL，流速 0.72 mL?min?1，采集周期 0.7 s，檢測波長280 nm，結果如圖2所示。從圖2可以看出，改造后的UV-1750能夠很好地應用于BSA的檢測。

圖2 BSA的初步分析

3.3 蛋清的分析及新蛋白質部分收集系統在實驗教學中的應用

蛋清的處理：取新鮮雞蛋(4 °C預冷)一個，分離蛋清(后續步驟都在4 °C下進行)，用PBS稀釋5倍，靜置30 min，離心3220 g (10 min)，收集上清備用。

實驗分析條件如3.2節(采樣周期調整為0.8 s)，上樣分析兩次，結果如圖3所示。從圖3中可以看出，蛋清中蛋白檢測情況良好且得到了一定的分離；兩次上樣分析的結果幾乎完全重疊，表明實驗重現性良好。復雜生物樣品蛋清的分析同時也明確了新蛋白質部分收集系統可以替代傳統的蛋白質部分收集系統，應用于實驗教學和科學研究的相關實驗中。

圖3 蛋清的分析

2019年上半年實驗室開設的生物化學實驗中實驗項目“凝膠過濾層析純化堿性磷酸酶”(堿性磷酸酶為學生從牡蠣中提取的樣品)的教學中，部分小組使用了新蛋白質部分收集系統，并取得了預期滿意的實驗結果。

4 結語

島津UV-1750的改造，拓展了儀器的使用功能，提高儀器的使用效率，該改造同樣適用于島津UV-1780等系列的相關產品。改造后的設備特別適用于實驗室樣品分離純化過程中的在線分析或監測(分光光度法)，同時不影響樣品的制備。該改造方法易于操作，理論上適用于實驗室常用的大部分分光光度計，易于推廣；分光光度計增加流動比色皿都很容易，且多數設備具有數據輸出接口，不同設備改造的區別主要在數據采集軟件方面，即使沒有相關軟件或現有軟件無法滿足要求，通過編程等信息化手段也不難實現。

儀器改造的初衷來源于實驗教學，并最終應用于實驗教學中。改造后的島津UV-1750可應用于傳統的蛋白質部分收集系統中，解決了核酸蛋白檢測儀和記錄儀長期在使用中產生的困擾，同時可以減少相關設備的購置，降低實驗室設備采購的成本。