木蝴蝶素抗膿毒癥潛在靶標的篩選與鑒定

陳 意，章玲玲，葉佳麗，陳桂榮，陳賽貞，徐煜彬

0 引言

膿毒癥是由于宿主對感染的反應失調，導致生命器官功能障礙[1]。膿毒癥是重癥監護病房(ICU)入院的主要原因之一，也是危重患者急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙的主要原因。流行病學研究表明，住院患者膿毒癥的發病率很高，在2011年，有57 000例嚴重膿毒癥患者被收入124家美國學術醫院，其中69%需要入住ICU，在過去10年，膿毒癥是非心臟重癥監護病房的第2位死亡原因，醫院死亡率為47%[2-6]。隨著對膿毒癥流行病學、生理機制等深入研究，嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者死亡率逐年降低[7]，但是到目前為止，對于膿毒癥并無特效藥，尋找膿毒癥有效藥物是目前急需任務之一。

木蝴蝶素(圖1)是從黃芩中提取的一種生物活性類黃酮，也是黃連解毒湯中抗膿毒癥的有效成分之一[8]。研究表明，木蝴蝶素具有多種藥理功能，包括抗氧化應激、抗轉移、抗細胞衰老、抗肝脂肪變性、抗炎等[9-12]。木蝴蝶素在抗氧化抗炎的同時，對肝臟等器官具有保護作用，而這些作用可能會改善膿毒癥癥狀，起到抗膿毒癥作用，但是木蝴蝶素抗膿毒癥的作用靶標及機制尚不明確。因此，本文基于網絡大數據，采用靶標預測及驗證的方法，對木蝴蝶素抗膿毒癥的潛在靶標進行篩選與分析[13-15]。

圖1 木蝴蝶素化學結構

1 材料

木蝴蝶素sdf格式文件，中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)數據庫(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，Swiss Targetprediction服務器(http://www.swisstargetprediction.ch)，DRAR-CPI服務器(https://cpi.bio-x.cn/drar)，分子對接服務器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 藥理參數和分子特性評價及靶標預測 首先通過TCMSP數據庫對木蝴蝶素體內過程的ADME(吸收、分布、代謝和排泄)以及分子特性進行評價。

2.2 DRAR-CPI 靶標預測 DRAR-CPI服務器(https://cpi.bio-x.cn/drar)可以通過化學蛋白質相互作用分析來預測化學成分的靶向蛋白，通過從PubChem數據庫下載木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)的sdf文件，將其上傳到DRAR-CPI服務器，參數為默認值，篩選Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss Targetprediction靶標預測 登陸Swiss TargetPrediction (http://www.swisstargetprediction. ch/)服務器，在Marvin for JavaScript Version 6.1上參照PubChem數據庫木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)結構上傳，對其進行靶標篩選。

2.4 木蝴蝶素抗膿毒癥靶標預測 將DRAR-CPI及Swiss Targetprediction服務器預測到共有的木蝴蝶素靶向蛋白作為潛在靶標信息，與OMIM(http://www.omim.org/)、CTD(https://ctdbase.org/)和TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數據庫中已報道的與膿毒癥相關疾病靶標進行匹配，選擇既是木蝴蝶素靶標蛋白又是膿毒癥的靶標蛋白進行后續分析。

2.5 分子對接 首先將“2.1”和“2.2”涉及到的相關蛋白PDB ID輸入到分子對接服務器(https://www.dockingserver.com/web/docking)，再將木蝴蝶素的sdf文件上傳到服務器，點擊開始對接，并對結果進行分析。

3 結果與討論

3.1 藥理參數和分子特性評價 掌握化合物的藥理參數與特性能夠深入地了解該化合物的成藥性能，明確合適的劑型，能減少藥物研發前期大量篩選操作。木蝴蝶素口服生物利用度(OB)為41.37%(>30%)，藥物相似度(DL)為0.23(>0.18)，可旋轉鍵數(RBN)為2，表明木蝴蝶素口服吸收較好，具有良好的成藥性[11]。而藥物半衰期(HL)為17.15，半衰期較長，能維持長時間的療效，可以考慮做成一般口服制劑。木蝴蝶素的分子量(MW)為284.28(<500)，油水分配系數(AlogP)為2.59 (<5)，氫鍵供體(Hdon)為2,氫鍵受體(Hacc)為5,均接近5，與Lipinski[16]的5原則較為一致，成藥可能性較高。

3.2 靶標預測 靶標預測是新藥開發的第一步，如何明確篩選化合物的靶向蛋白已經成為藥物開發的核心問題。分子反向預測靶標的計算釣靶方法也已經廣泛應用于這一目的。從Swiss Targetprediction服務器篩選得到木蝴蝶素的相關靶標15個；通過DRAR-CPI共篩選出388個靶標，其中Z′<-0.5的靶標共有88個，Z′<-0.5表明具有良好的靶向性；將Swiss Targetprediction服務器和DRAR-CPI篩選到的靶標合并，刪除重復靶標，總共得到97個靶標。

將“sepsis”輸入到CTD、OMIM以及TTD3個數據庫，從CTD篩選到26個靶標蛋白，OMIM篩選到117個靶標蛋白，TTD篩選到21個蛋白，其中共有疾病靶標149個，將木蝴蝶素預測到的97個靶標蛋白與疾病靶標進行匹配，發現既是分子靶標又是疾病靶標的蛋白有9個，分別為SERPINE1、CTSG、MIF、PROC、F9、NOS3、NOS2、ADORA1和ADORA2A，具體篩選流程見圖2。

圖2 木蝴蝶素靶標鑒定流程圖

3.3 分子對接 本實驗采用dockingserver分子對接服務器對木蝴蝶素和相關蛋白進行了分子對接。結果顯示，自由結合能小于-5 kcal/mol的靶標有PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1，表明木蝴蝶素具有結合這些靶標的能力[17]，結果見表1。

表1 木蝴蝶素與靶標蛋白相互作用分子對接數據

圖3 木蝴蝶素與NOS3和NOS2分子相互作用

從圖3可見，木蝴蝶素與NOS3的疏水相互作用殘基包括ASN366、GLN247、GLU361、TYR357、PRO334、VAL336、ARG372；木蝴蝶素與NOS2的疏水相互作用殘基包括ARG381、TRP463、ILE462、MET120、PHE476、TRP461、TRP90、GLU479、SER118，表明木蝴蝶素可能通過這些關鍵殘基與NOS3和NOS2產生交互作用，從而發揮相應的藥效。

膿毒癥是一種危及生命的器官功能障礙，是由于宿主對入侵病原體的反應失調所致，其特征可能是全身炎癥或某種免疫麻痹，嚴重者常常伴隨著急性肺損傷，微循環障礙，細胞病變性缺氧，以及心功能障礙等[18-19]。盡管隨著膿毒癥機制研究的深入，開展了治療創新，但是嚴重膿毒癥以及膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高[20]，仍然需要尋找更多有效的治療措施去攻克這一難題。本研究發現，木蝴蝶素可能通過結合PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1起到抗膿毒癥的作用。

PROC和F9都屬于凝血因子，參與機體的凝血級聯反應，也是血管內彌散性凝血的生物標志物，在維持血液通透性和調節抗凝方面發揮著重要作用[21-22]，同時，PROC也是重要的內皮細胞標志物[23]，而在膿毒癥的發生發展中常常伴隨著凝血功能紊亂以及內皮組織的損傷，因此，這兩者與膿毒癥密切相關，更為重要的是，PROC的水平也反映了膿毒癥患者的預后情況[24]。巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)是一種與急性和慢性炎癥包括膿毒癥、自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化、斑塊不穩定和肺動脈高壓有關的促炎細胞因子，也是免疫應答的重要調節因子[25]，其能促進炎癥、增殖和血管生成物活性，參與感染性、炎癥性以及自身免疫性疾病的發病機制，并且在膿毒癥患者中高表達，也被認為是膿毒癥的一個潛在生物標志物[26]。

膿毒癥是由內毒素釋放引發的炎癥反應，常進展為難治性低血壓，多器官系統衰竭和死亡。炎癥反應通常是通過巨噬細胞活化和促炎細胞因子的釋放來介導的，在這些信號級聯誘導的介質中，NO是低血壓和末端器官損傷的關鍵調節因子，而NO的生成則依賴于一氧化氮合成酶NOS2和NOS3[27-28]。此外，NOS2可誘導心肌抑制，NOS3可拮抗心肌抑制，兩者相互平衡，在膿毒癥發生心肌抑制病理生理發展過程中起著重要的作用[29]。CTSG是一種中性粒細胞蛋白彈性酶，功能類似殺菌劑，可以導致細胞和組織損傷，膿毒癥發展中的器官損傷可能是由于亞毒氧化劑(超氧化物、NO等)與大量膜穿孔劑(溶血素、陽離子蛋白等)協同作用引起的，而CTSG作為亞毒性蛋白可以極大地增加這種損傷[30-31]。研究表明，腺苷受體作為炎癥調控靶標是一個非常好的選擇，ADORA1和ADORA2A均是G蛋白偶聯受體，在機體組織細胞中介導炎癥反應，調控免疫應答，在膿毒癥發展進程中起著重要作用，如抑制ADORA1能降低白細胞吞噬和產生氧自由基的能力，ADORA1基因缺陷會導致促炎因子水平降低，而ADORA2A激活PKA，產生抗炎作用，在藥理學上靶向治療炎癥、膿毒癥、癌癥、神經變性和帕金森病[32-34]。

綜上所述，木蝴蝶素可能通過調節PROC和F9促進凝血系統恢復；通過調節MIF、ADORA1和ADORA2A調控免疫應答發揮抗炎作用；通過調節CTSG、NOS2和NOS3，起到保護膿毒癥損傷器官的作用，最終通過緩解膿毒癥整體癥狀和炎癥等水平起到抗膿毒癥作用。本研究主要通過現有的大數據對木蝴蝶素抗膿毒癥的靶標進行了篩選與鑒定，但是由于數據庫計算方法的缺陷，并不能確定木蝴蝶素潛在劑量的效應結果，盡管這些靶標已通過分子對接證實，但是仍需要通過體內動物實驗或者體外實驗進行進一步驗證，但是盡管如此，本研究所使用的方法可以節約資源，減少大量靶標的篩選步驟，有助于快速有效識別木蝴蝶素的藥物靶標。