用UPLC-MS/MS 法測(cè)定肝功能不全患者血漿中伏立康唑的濃度

劉琳琳，宋洪濤，嚴(yán) 佳 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350025）

伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑類廣譜抗真菌藥，主要用于治療由侵襲性曲霉菌、念珠菌等引起的侵襲性感染[1-2]。伏立康唑血藥濃度受多種因素影響，其中，肝臟和腎臟疾病[3]是導(dǎo)致伏立康唑較大個(gè)體化差異的重要因素，伏立康唑的臨床療效及不良反應(yīng)與藥物濃度有明顯相關(guān)性[4]。目前用于伏立康唑的血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法主要有：酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法[5]，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]，其中，酶聯(lián)免疫法存在假陽性，高效液相色譜法檢測(cè)時(shí)間較長。本研究采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法靈敏度高，簡便快速，適用于伏立康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)。由于伏立康唑大部分在肝臟代謝，肝臟疾病患者的血藥濃度具有可變性和不可預(yù)知性，尤其是肝功能不全的患者，治療藥物監(jiān)測(cè)對(duì)其尤為重要。然而，國內(nèi)針對(duì)肝功能不全患者的伏立康唑藥物濃度監(jiān)測(cè)鮮有報(bào)道，筆者應(yīng)用自建方法對(duì)肝功能不全患者進(jìn)行伏立康唑治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)，根據(jù)患者臨床癥狀和生化指標(biāo)及時(shí)調(diào)整用藥方案，避免了藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，具有一定的臨床意義。

1 材料

LC-30AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB Qtrap 5500 型質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源 (美國AB SCIEX 公司)。AL 204 型分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Simplicity 純水儀(美國Millipore 公司)；H1850R 低溫高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；XH-B 型旋渦混合器（湖北姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）。伏立康唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100862-201402，純度99.8%)；氟康唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100314-201605，純度99.8%)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18HP（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相：水 -乙腈（15∶85）；流速: 0.3 ml/min，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式監(jiān)測(cè)。噴霧電壓（IS）5 550 V；離子化溫度（TEM）550 ℃；霧化氣（GS1）55 psi；輔助氣（GS2）60 psi；氣簾氣（CUR）)20 psi；碰撞氣（CAD）10 psi；去簇電壓（DP）80 V。伏立康唑和內(nèi)標(biāo)氟康唑的定量分析離子分別為m/z：350.9/282.2 和m/z：307.0/238.0；碰撞能量分別為25 V 和22 V。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取伏立康唑適量，置10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/ml 伏立康唑儲(chǔ)備液，置2～8 ℃冰箱保存，備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取氟康唑適量，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/ml 的氟康唑儲(chǔ)備液，置2～8 ℃冰箱保存，備用。臨用前用甲醇稀釋成500 ng/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 樣品處理方法

取樣本血漿50 μl，加入500 ng/ml 內(nèi)標(biāo)液50 μl，加入甲醇250 μl，在微型混合器上渦流振蕩1 min混勻，13 000 r/min 低溫4 ℃離心5 min，取上清液1 μl 進(jìn)樣分析。

2.5 專屬性考察

分別取人空白血漿、人空白血漿加伏立康唑?qū)φ掌泛蛢?nèi)標(biāo)溶液、臨床使用伏立康唑的患者血漿樣品加內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)。伏立康唑和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.61、3.64 min，峰形良好，血漿中其他成分對(duì)伏立康唑和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無干擾，方法的專屬性好。結(jié)果見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

取不同來源的健康人血漿，精密加入不同濃度的對(duì)照品溶液，配制成濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。以伏立康唑濃度為橫坐標(biāo)，伏立康唑峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行加權(quán)回歸計(jì)算，回歸方程為：Y=0.732 36 X?0.013 55（r=0.999 5）。結(jié)果表明，人空白血漿中伏立康唑在0.1～20 μg/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法伏立康唑定量下限（S/N＞10）為0.1 μg/ml。

2.7 精密度試驗(yàn)

以人空白血漿為基質(zhì)，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個(gè)水平的質(zhì)控樣品各6份，連續(xù)檢測(cè)3 d，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后分析測(cè)定，計(jì)算其日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

2.8 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取6 個(gè)不同來源的健康人空白血漿作為基質(zhì)，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個(gè)水平的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，得到伏立康唑峰面積A1；以6 個(gè)不同來源的人空白血漿甲醇沉淀提取液配制濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個(gè)水平的樣品各6 份，得到伏立康唑峰面積A2；以流動(dòng)相代替空白血漿，同樣方法配制備0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個(gè)水平的樣品各6 份，得到伏立康唑峰面積A3；以A1/A2的值計(jì)算提取回收率，A2/A3的值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以人空白血漿為基質(zhì)，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的質(zhì)控樣品，考察樣品室溫放置穩(wěn)定性（12 h）、凍融穩(wěn)定性（反復(fù)凍融3 次）、冷凍穩(wěn)定性（?20 ℃放置30 d），結(jié)果見表2。

2.10 臨床樣本測(cè)定

圖1 伏立康唑和內(nèi)標(biāo)提取離子色譜圖

表1 方法學(xué)考察結(jié)果(n=6)

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=6)

對(duì)本院10 名真菌感染使用伏立康唑的肝功能不全患者進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，穩(wěn)態(tài)谷濃度最大值為18.7 μg/ml，最小值為0.97 μg/ml。在 Pascual 等[7]的研究中，設(shè)定伏立康唑的治療藥物濃度范圍為1.0～5.5 μg/ml。其中一名患者肝硬化、膽石癥伴梗阻性黃疸，行經(jīng)內(nèi)鏡逆行性胰膽管造影術(shù)（ERCP）后膽紅素、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）進(jìn)行性升高，存在膽管感染，且患者反復(fù)腹瀉，合并腸道真菌感染，予加用伏立康唑抗真菌治療。用藥前肌酐值81 μmol/L，堿性磷酸酶259 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶69 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶116.3 U/L，伏立康唑膠囊口服給藥，負(fù)荷劑量400 mg，q12 h，維持劑量為200 mg，q12 h，達(dá)到穩(wěn)態(tài)谷濃度后監(jiān)測(cè)濃度值為18.7 μg/ml，復(fù)查生化，肌酐值151 μmol/L，堿性磷酸酶324 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶154 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶154 U/L，膽紅素仍持續(xù)性升高，伴腎功能不全，為防止發(fā)生嚴(yán)重肝損害和不良反應(yīng)，予停藥處理。還有一名患者肝炎后肝硬化、肝功能衰竭伴黃疸，糞便培養(yǎng)出黑霉菌，予伏立康唑抗真菌治療，用藥前肌酐值49 μmol/L，堿性磷酸酶198 U/L，谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶99 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶211 U/L。伏立康唑片劑口服給藥，負(fù)荷劑量400 mg，q12 h，維持劑量為200 mg，q12 h，達(dá)到穩(wěn)態(tài)谷濃度后監(jiān)測(cè)濃度值為10.7 μg/ml，已超出伏立康唑治療窗濃度高限，患者訴視物變黃，初步考慮為藥物引起的不良反應(yīng)，臨床醫(yī)生調(diào)整劑量為 100 mg，q12 h，達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度后復(fù)測(cè)伏立康唑的血藥濃度為5.1 μg/ml，視物變黃較前緩解，無視物模糊，黃疸下降，凝血酶原活動(dòng)度（PTA）改善，感染癥狀有所好轉(zhuǎn)。

3 討論

在色譜法測(cè)定伏立康唑血藥濃度的文獻(xiàn)中，前人多采用乙酸乙酯-環(huán)己烷或者三氯甲烷萃取劑提取[8-9]，前處理的過程操作比較復(fù)雜，時(shí)間長。本研究使用甲醇蛋白沉淀方法，能夠較好地去除血漿樣本中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的影響，前處理方法簡單快速，縮短了檢測(cè)時(shí)間。所選內(nèi)標(biāo)氟康唑穩(wěn)定性好，保留時(shí)間適宜且峰形好，定量準(zhǔn)確，同時(shí)，液相方法使用乙腈-水等度洗脫，將分析時(shí)間縮短至6 min 以內(nèi)，分析效率顯著提高。綜上所述，本研究建立的伏立康唑血藥濃度的測(cè)定方法具有較好的專屬性，操作簡便，回收率好、靈敏度高，可滿足伏立康唑日常血藥濃度的測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)研究的需要，為合理使用伏立康唑提供依據(jù)。

伏立康唑谷濃度低于治療窗最低濃度時(shí)臨床治療效果不好，當(dāng)谷濃度高于治療窗最大濃度時(shí)，中樞系統(tǒng)[10]和肝功能[11]的不良反應(yīng)發(fā)生率會(huì)明顯升高。其中，視覺障礙最為常見，與用藥劑量較大或血藥濃度較高有關(guān)，一般用藥劑量減少或停藥后可完全恢復(fù)。患者個(gè)體化差異和藥物間相互作用等因素會(huì)導(dǎo)致血藥濃度偏高或偏低，影響伏立康唑的治療效果。此外，患者肝功能不全會(huì)影響伏立康唑的代謝，導(dǎo)致代謝時(shí)間減慢，半衰期延長，藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率增加，從而使得肝損害進(jìn)一步加重。

本例中兩名患者肝功能損害較嚴(yán)重，伏立康唑用藥需更加謹(jǐn)慎。伏立康唑在腦脊液和腦組織液中可達(dá)到較高濃度，有研究表明伏立康唑藥物濃度與視覺副作用的發(fā)生率呈正相關(guān)，臨床藥師通過監(jiān)測(cè)伏立康唑血藥濃度，及時(shí)調(diào)整用藥，結(jié)合患者實(shí)際病情制訂個(gè)體化給藥方案，提高治療效果，避免了藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，為臨床肝功能不全患者合理用藥提供依據(jù)。