養血生發合劑質量標準提升的實驗研究

張韶湘 鄒昱蕾 李江 余曉玲 陳凌云

摘要：目的 建立養血生發合劑的質量標準。方法 采用TLC對本品中當歸、補骨脂進行定性鑒別。采用HPLC對本品中大黃素進行含量測定。采用單因素試驗法，對含量測定中供試品溶液的前處理方法進行考察。結果 可檢出當歸和補骨脂且陰性無干擾。大黃素在6.17～79.35 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y=34.43x+5.31（R2=0.999 8），平均加樣回收率為103.42%（RSD=2.16%，n=6），其余方法學考察項均合格。結論 所建立的質量標準可以用于養血生發合劑的質量控制。

關鍵詞：養血生發合劑;質量標準;薄層鑒別;含量測定;大黃素

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）03-0072-04

養血生發合劑是昆明市中醫醫院的院內制劑，運用于臨床長達30余年。該制劑由制何首烏、當歸、補骨脂（鹽）、菟絲子（鹽）、牛膝、茯苓共6味藥經提取后制備而成，具有養血生發、烏須發的功效，用于腎氣不足、氣血虧虛所致的須發脫落、早白。方中制何首烏為君藥，具有補肝腎、強筋骨、益精血、烏須發的功效，所含蒽醌類成分大黃素具有抗衰老、保護肝腎、增強免疫力等作用[1-3]，其余當歸、補骨脂（鹽）、菟絲子（鹽）等藥材亦具有保肝強腎、抗衰老、抗氧化、增強免疫功能等效果[4-6]。

由于該合劑現行質量標準內容過于簡單，檢查項目專屬性不強，且沒有含量測定項，很難實現對該制劑的質量控制。因此，本研究采用TLC法對方中各藥味進行定性鑒別研究，以建立快速、靈敏、專屬性強的定性鑒別方法;同時，采用單因素試驗法，對含量測定中供試品溶液的制備條件進行考察，以確定適宜的供試品溶液制備方法，并采用HPLC法建立養血生發合劑中主要有效成分大黃素的含量測定方法，為養血生發合劑的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100系列高效液相色譜儀（Agilent公司）;T-1000型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，迪馬科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）;硅膠G板（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）;點樣毛細管（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試藥 當歸對照藥材（批號：120927-201617），補骨脂對照藥材（批號：121056-201605），大黃素對照品（批號：110756-201512，含量以98.7%計）均購自中國食品藥品檢定研究院。養血生發合劑（批號：180811、180812、180813，由昆明市中醫醫院提供）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 當歸的薄層鑒別 取本品20 mL，濃縮至約10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[7]。取當歸對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取不含當歸的陰性樣品溶液，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進行試驗，以硅膠G板為吸附劑，對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照溶液點樣量各5、10、10 μL，以正己烷-乙酸乙酯（7：1）為展開劑，展開，待晾干后于365 nm紫外光燈下檢視。結果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。結果見圖1。

2.1.2 補骨脂的鑒別 取本品20 mL，濃縮至約10 mL，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液[8]。取補骨脂對照藥材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL超聲提取10 min，濾過，料液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取不含補骨脂的陰性樣品溶液，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進行試驗，以硅膠G板為吸附劑，各溶液點樣量均為10 μl。以正己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，待晾干后，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，于365 nm紫外光燈下檢視。結果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。結果見圖1。

2.2 大黃素含量測定

2.2.1 色譜條件及系統適應性 以Diamonsil C18為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（79：21）為流動相，254 nm為檢測波長，在30℃柱溫，10 μl進樣量，1.0 mL/min流速條件下檢測。理論板數按大黃素峰計算不低于5000，大黃素峰對稱因子在0.95～1.05內，且該峰與附近峰分離度≥1.57，陰性對照無干擾。結果見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取本品30 mL，水浴蒸干，取8%鹽酸溶液20 mL分次加入蒸發皿中，溶解殘渣并洗滌蒸發皿，溶解液合并洗滌液，移置圓底燒瓶中，加三氯甲烷20 mL，水浴加熱回流3 h，取出，冷卻。用分液漏斗分取三氯甲烷層（取10 mL三氯甲烷分次洗滌燒瓶，洗液并入分液漏斗中），剩余鹽酸溶液再用三氯甲烷液萃取3次，每次15 mL，合并上述所有三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解定容至5 mL，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取不含制何首烏的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 線性關系及范圍考察 精密稱取大黃素對照品（含量以98.7%計）0.01005 g，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取該溶液1mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，得濃度為79.35 μg/mL的溶液，取該溶液3mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，依次稀釋，得濃度為28.56，17.14，10.28，6.17 μg/mL的對照品溶液。分別吸取上述各溶液，按照“2.2.1”項下的條件檢測。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=34.43x+5.31（R2=0.999 8）。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液和“2.2.3”項下供試品溶液，按“2.2.1”項下條件，分別在0，4，8，12，16 h測定大黃素的峰面積，計算得對照品溶液峰面積的RSD=0.69%，供試品溶液峰面積得RSD=1.56%，表明二者的穩定性符合方法學要求。

2.2.7 重復性試驗 取同一批次養血生發合劑6份，每份30mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下條件檢測，計算得大黃素平均含量為6.34 μg/mL，RSD=1.87%（n=6），表明該方法重復性好。

2.2.8 準確度試驗 取同一批次養血生發合劑（含量為6.34 μg/mL）6份，每份15 mL，分別加入濃度為44.29 μg/mL的大黃素對照品溶液各2 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按”2.2.1”項下方法進樣測定，得平均加樣回收率是103.42%，RSD=2.16%（n=6），表明所建方法符合含量測定要求。結果見表1。

2.2.9 含量測定 取3批次養血生發合劑（批號見表2），每批次取2份藥液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下方法檢測，計算大黃素含量。結果顯示，3批次養血生發合劑中大黃素平均含量為6.33 μg/mL，RSD =1.32%。結果見表2。

3 討論

本研究建立了養血生發合劑中當歸、補骨脂的TLC鑒別方法。同時，由于薄層鑒別常受點樣量、溫度、濕度、薄層板廠家、樣品批次等因素的影響，本研究依據《云南省中藥材（民族藥材）質量標準研究技術指導原則（試行）》對2藥的鑒別進行了方法學考察。結果表明，在15℃～25℃，50%～90%濕度，兩個不同廠家（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）薄層版條件下，3個批次養血生發合劑均可鑒別出當歸和補骨脂。方中其余4藥的TLC鑒別中，菟絲子、牛膝、茯苓均存在陰性干擾，何首烏中的大黃素已作為定量指標，故本研究并未建立何首烏及上述3味藥的TLC鑒別方法。

本文對含量測定中供試品溶液的前處理方法進行了較系統的研究。結果表明，是否進行水解、水解所用酸的種類、所用酸的用量、水解時間、水解后酸液的萃取次數、水解所用酸的濃度對大黃素的檢測均有影響，其中前4項影響較大，其余則影響較小。

本研究對當歸中的阿魏酸進行了含量測定研究，發現其存在陰性干擾且含量偏低。在對菟絲子中的金絲桃苷進行測定時，未能檢出金絲桃苷，推測可能與金絲桃苷在本合劑中的穩定性不佳有關。同時，補骨脂中的補骨脂素亦存在陰性干擾，而異補骨脂則未能檢測到。牛膝中的β-蛻皮甾酮在原藥材中的含量較低（2015年版中國藥典規定應≥0.030%），考慮到處方藥材制備為口服液后所含含量更低，故不宜作為定量指標。剩余的茯苓在藥典中則無“含量測定”項，故本研究建立了何首烏中大黃素的含量測定方法。

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（收稿日期：2020-09-17）