拔伸松動手法對兔膝關節骨性關節炎關節液中自由基代謝的影響

王春林 田啟東 胡鸞 向勇 艾健 趙志勇 董有康

摘要：目的 研究拔伸松動手法對兔膝關節骨性關節炎（KOA）模型兔關節液中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化脂質（LPO）、丙二醛（MDA）的影響，探討拔伸松動法促進兔KOA軟骨損傷修復的機制。方法 將80只健康成年家兔隨機分為實驗組、對照組、模型組、空白組，每組20只。除空白組外，其余各組采用Videman T法建立KOA模型。實驗組采用拔伸松動手法干預;對照組塞來昔布膠囊經胃灌藥干預;模型組和空白組，不做治療干預。實驗完成后，抽取實驗兔膝關節液，黃嘌呤酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）含量，ELISA法檢測過氧化脂質（LPO）含量。結果 實驗組關節液中SOD濃度高于對照組和模型組（P<0.05）;LPO濃度和MDA濃度均低于對照組和模型組（P<0.05）。結論 拔伸松動手法可以升高KOA模型兔關節液中SOD濃度，降低LPO和MDA濃度，增強機體清除氧自由基的能力，促進損傷軟骨的修復。

關鍵詞：拔伸松動手法;關節骨性關節炎;SOD;LPO;MDA

中圖分類號：R684.3 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）03-0069-04

【Abstract】Objective： To study the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on superoxide dismutase （SOD）， lipid peroxide （LPO） and malondialdehyde （MDA） in rabbit synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis （KOA） model and to explore the mechanism of pulling-stretching-loosening method to promote the repair of rabbit KOA cartilage damage. Methods： 80 healthy adult rabbits were randomly divided into experimental group， control group， model group， and blank group， 20 rabbits per group. Except for the blank group， the other groups were given Videman T method to establish KOA models. The experimental group was intervened by pulling-stretching-loosening manipulation， the control group was intervened by intragastric administration of Celecoxib capsules and the model group and the blank group were not treated with therapeutic intervention. After the experiment was completed， the experimental rabbit knee joint fluid was extracted. The xanthine enzyme method was used to determine the superoxide dismutase （SOD） activity， the thiobarbituric acid method was used to detect the content of malondialdehyde （MDA）， and the ELISA method was used to detect lipid peroxide （LPO） content. Results： The concentration of SOD in the joint fluid of the experimental group was higher than that of the control group and the model group （P<0.05）. The concentration of LPO and MDA of the experiment group were lower than that of the control group and the model group （P<0.05）. Conclusion： The pulling-stretching- loosening manipulation can increase the SOD concentration in the synovial fluid of KOA model rabbits， reduce the concentration of LPO and MDA， enhance the bodys ability to scavenge oxygen free radicals and promote the repair of damaged cartilage.

【Key words】Pulling-stretching-loosening manipulation; Joint osteoarthritis; SOD; LPO; MDA

膝關節骨性關節炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一種以膝關節軟骨變性、損傷，軟骨基質降解為早期病理特征的慢性骨關節疾病。一般認為KOA的發病與氧自由基代謝、炎癥介質、細胞因子及自身免疫有關[1-3]。氧自由基代謝失衡是KOA病變的重要機制，其中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）、過氧化脂質（LPO）含量增高，軟骨細胞凋亡加速[3]。本研究在臨床實踐基礎上，觀察拔伸松動手法對兔KOA模型關節液中SOD、MDA、LPO含量的變化，探討拔伸松動法對兔KOA損傷軟骨修復的機制，為臨床推廣應用提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年家兔80只，普通級別，單重：1.8～2.5Kg，雌雄不限，重量分布均一，均由昆明醫科大學實驗動物學部提供。

1.2 試劑盒 兔超氧化物歧化酶ELISA檢測試劑盒、過氧化脂質ELISA檢測試劑盒、兔丙二醛ELISA檢測試劑盒。

1.3 造模 隨機分為4組，每組10 只：實驗組、對照組、模型組、空白組。穩定飼養7 d后，采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關節6 周，制作兔膝骨性關節炎模型。

1.4 實驗 分別于造模完成后3 d開始，予各組相應的干預措施。

1.4.1 實驗組 給予拔伸松動手法治療干預：（1）按揉膝眼、血海、鶴頂、陽陵泉、陰陵泉、足三里、委中諸穴，30秒/穴。（2）屈伸患膝關節15次。（3）拔伸法施以患膝10秒后放松，然后在拔伸下分別以小魚際固定于膝關節下緣之內側和外側，向對側推按5次（外側向內側，內側向外側）。（4）五指提拿髕骨10次，順時針和逆時針活動髕骨5次，再上下左右推動髕骨各10次。（5）屈伸患膝關節15次。（6）拔伸患膝10秒，在拔伸過程中作膝關節小幅度內旋和外旋運動。每日1次，每次10 min，連續治療20次。

1.4.2 對照組 給予塞來昔布膠囊經胃灌藥干預，給藥量按動物與人體的每kg體重等效劑量折算系數表計算給藥劑量，大白兔劑量（mg/kg）=折算系數（W=3.3）*兔體重*人劑量（mg/kg）/人體重。將膠囊藥物粉末攪拌于溫開水中，配制成含藥量為8.8mg/mL混懸液，放入冰箱備用，每日1次，連續治療20次。

1.4.3 模型組 造模后正常飼養，不予干預措施，正常飼養20 d后取標本。

1.4.4 空白組 不予造模，不予干預措施，正常飼養20 d后取標本。

1.5 取材檢測 所有動物于實驗結束后1 d取材。耳緣靜脈注射空氣20 mL栓塞處死。取關節液：從髕上囊部位注入關節腔，注入0.9%的生理鹽水0.5 mL，反復屈伸活動膝關節后，抽出腔內灌洗液。做好標記后立即置于-20 ℃冰箱中保存備檢。

1.6 檢測指標 黃嘌呤酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA）含量，ELISA法檢測過氧化脂質（LPO）含量，以此作為了解自由基的反應指標。

1.7 統計學方法 實驗數據應用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，各組數據以（x[TX-*3/8]±s）表示。組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 4組治療后家兔關節液中SOD濃度 F值=72.059，實驗組與對照組比較P=0.04<0.05顯著性差異;實驗組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實驗組與空白組比較P=0.415>0.05無顯著差異。見表1。

2.2 4組治療后家兔關節液中LPD濃度 F值=36.099，實驗組與對照組比較P=0.05<0.05顯著性差異;實驗組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實驗組與空白組比較P=0.952>0.05無顯著差異。見表2。

2.3 4組治療后家兔關節液中MDA濃度 F值=129.99，實驗組與對照組比較P=0.00<0.05顯著性差異;實驗組與模型組比較，P=0.000<0.05有顯著性差異;實驗組與空白組比較P=0.78>0.05無顯著差異。見表3。

3 討論

目前認為KOA的發病與氧自由基代謝、炎癥介質、細胞因子及自身免疫有關，在力學和生物學因素共同作用下導致軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡，病理結果為滑膜炎癥反應和關節軟骨損傷。研究證實：KOA患者體內氧自由基含量增高，可能是在免疫反應核吞噬過程中產生和或關節內產生的細胞因子刺激軟骨細胞和滑膜細胞超常產生大量自由基[5]，SOD是超氧陰離子的清除劑，MDA為脂質過氧化的產物，二者是檢測機體氧自由基水平的常用配對指標。SOD活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力，MDA含量的高低可間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，二者可作為動態評價防治KOA效果的客觀指標。LPO是體內細胞膜性結構中的多介不飽和脂肪酸受到氧自由基的作用生成的脂質過氧化，膜脂質的過氧化，使膜結構和細胞功能受損而引起多種疾病，其變化可反映組織代謝障礙，細胞結構與功能損害的指標。SOD、LPO、MDA等氧自由基代謝失衡是KOA發病的重要病理改變，SOD對細胞損傷具有保護作用，對氧自由基代謝保持平衡起著至關重要的作用。KOA患者體內氧自由基含量增高，通過對軟骨基質生理功能的改變，促使軟骨細胞退變、凋亡[3]。

推拿手法治療膝關節骨性關節炎已在臨床廣泛應用，主要選用按、揉、推、拿、運動關節等手法為主。戴七一等[6]采用揉髕手法治療實驗性兔膝骨性關節炎，探究軟骨組織及細胞超微結構的影響，發現揉髕手法可明顯延緩兔膝關節軟骨組織的退行性改變。何偉等[7]人采用隨機對比研究松凝分筋手法治療膝關節骨性關節炎的臨床療效，證明松凝分筋手法的特異性治療作用，療效確切且可靠。拔伸松動法包括膝關節屈伸法、拔伸下推按法、髕骨松動法、拔伸下微旋法，前期的臨床觀察證實，膝關節拔伸松動手法治療KOA療效確切[8]，動物實驗研究證實拔伸松動手法可降低KOA兔膝關節液中白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，改善膝骨性關節模型的關節活動度，修復退變的軟骨組織[9-10]。

本實驗研究結果顯示，兔KOA模型關節液中MDA和LPO濃度升高，對比空白組均具有顯著性差異（P<0.05），提示氧自由基濃度增高，抑制了軟骨細胞的增殖和軟骨基質蛋白多糖及膠原的合成，加速軟骨基質的降解，導致關節軟骨損傷。而關節液中SOD降低（P<0.05），提示氧自由基清除能力降低，受損細胞修復能力下降。研究結果表明，實驗組通過拔伸松動手法治療干預后，關節液中的SOD濃度上升，LPO、MDA含量降低，與對照組（灌服塞來昔布組）和模型組比較有顯著性差異（P<0.05），說明拔伸松動法可促進氧自由基的清除，減少氧自由基對軟骨細胞結構和功能的損害，有利于兔KOA損傷軟骨的修復。拔伸松動法治療KOA有效，其作用機制可能為升高SOD濃度，降低LPO、MDA含量，從而改善KOA氧自由基代謝水平，提高抗氧化能力，促進機體修復損傷的軟骨。本研究為臨床推廣應用拔伸松動手法治療KOA提供了客觀依據。

參考文獻：

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[10]王春林，向勇，田啟東，等.“拔伸松動手法”對膝骨性關節炎兔白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響[J].環球中醫藥雜志，2014：7（2）85-88.

（收稿日期：2020-11-09）