穿心蓮內酯對膿毒癥大鼠急性心肺組織損傷和炎癥反應的影響*

楊敏華，姚友杰，王娟，陳亞奇，劉高仁，王森

(1.河南中醫藥大學第二附屬醫院/河南省中醫院急診內科，鄭州 450002；2.鄭州大學第一附屬醫院心內科，鄭州 450052；3.河南中醫藥大學康復學院，鄭州 450008)

膿毒癥(spesis)是重癥監護病房死亡發生的主要原因之一，主要表現為炎癥遞質大量釋放、彌漫性血管內凝血及內皮細胞功能障礙[1]。其中，心臟和肺臟是膿毒癥侵犯的常見靶器官，也是造成膿毒癥患者死亡的主要原因[2]。膿毒癥發生時，伴隨著大量炎癥細胞浸潤，致使促炎-抗炎動態平衡被打破。目前，對膿毒癥的治療主要以控制炎癥反應、減輕臟器損傷為主。穿心蓮內酯(andrographolide，AG)是從植物穿心蓮葉片中提取得到的一種二萜內酯，具有抗病毒、抗炎抗菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化和增強免疫等[3-7]，在治療關節炎、神經炎、椎間盤退變等炎癥性疾病中已得到廣泛應用[8-11]。已有研究表明AG可用于治療膿毒癥[12-14]，但AG對膿毒癥的具體作用機制尚不清楚。因此，本文用脂多糖誘導建立膿毒癥模型大鼠，探討AG對模型大鼠的心、肺組織損傷和炎癥反應的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級、雄性、8～10周齡、SD大鼠60只，體質量(260.7±21.5)g，購自北京維通利華公司，動物質量合格證號：SCXK(京)2014-0001，動物使用的倫理審批號：LLPZ-012。飼養溫度26～28 ℃，相對濕度50%～60%，自由采食和飲水，適應性飼養7 d后進行實驗，所有實驗符合動物實驗學的3R原則。

1.2試劑與儀器 AG粉末購自美國Sigma公司，含量≥98%，批號：365645；利奈唑胺購自中國食品藥品檢定研究院，含量≥99%，批號：130640-201901，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC，購自美國Biovision公司，批號：1676-100)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號：D006-1-1)購自南京建成生物工程研究所；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國RB公司；TRIzol試劑盒(批號：15596026)購自美國ThermoFisher公司；BCA蛋白定量試劑盒(P0012S)購自上海碧云天生物技術研究所；抗體購自英國Abcam公司；電化學發光(ECL)化學發光液(批號：WP20005)購自美國Invitrogen公司。聚合酶鏈反應(PCR)儀、電泳儀及半干轉膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司。

1.3方法

1.3.1建模和分組給藥 ①將大鼠隨機分為6組，每組10只：正常對照組，模型對照組，AG小劑量、中劑量、大劑量組(LPS+AG 2.5 mg、LPS+AG 5 mg和LPS+AG 10 mg)組，利奈唑胺(linezolid，LNZ)組(LNZ 25 mg)。除正常對照組外，各組大鼠均腹腔注射LPS(10 mg·kg-1)復制膿毒癥大鼠模型[15]，造模后通過觀察大鼠呼吸頻率、皮溫、心率、口鼻分泌物、精神狀態等判斷造模成功與否。AG小劑量、中劑量、大劑量組于造模后立即、8 h和16 h給予AG 2.5，5，10 mg·kg-1，利奈唑胺組給予利奈唑胺25 mg·kg-1，正常對照組和模型對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。②另取大鼠隨機分為5組：正常對照組、模型對照組、AG大劑量組(AG 10 mg)、PDTC+模型組(PDTC 50 mg)和PDTC+AG大劑量組。造模方法、給藥方法、取材時間同上。造模24 h后處死大鼠，采樣進行后續實驗。

1.3.2肺濕/干重比值(W/D)測定 取各組大鼠肺臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗凈，吸去多余水分，稱定質量，記為濕重(W)。用溫箱在80 ℃條件下干燥48 h后，再次稱定質量，記為干重(D)。W/D=(濕重-干重)/干重。

1.3.3HE染色檢測心肺組織病理損傷 取各組心臟、肺臟用PBS充分洗凈，10%中性甲醛固定，經常規脫水、透明、浸蠟和包埋過程，制成切片厚度4 μm。經過HE染色后，在光學顯微鏡下觀察心臟、肺臟病理學改變。

1.3.4ELISA檢測大鼠心肌損傷標記物和炎癥細胞因子含量 取各組心肌組織適量，制成1：9勻漿液，4 ℃條件下3000 r·min-1×10 min(離心半徑r=13.5 cm)，收集上清液，嚴格按照試劑盒操作，測定心肌損傷標記物肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)含量。取各組大鼠眼眶靜脈血，4 ℃條件下3000 r·min-1×10 min(離心半徑r=13.5 cm)，收集上清液，嚴格按照試劑盒操作，測定炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)的含量。

1.3.5Western blotting檢測心肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65的蛋白表達水平 用RIPA蛋白裂解液提取各組心臟和肺臟總蛋白，用BCA法測定并調平蛋白濃度。每組取等量蛋白質用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質2 h，加入一抗(1：500)，4 ℃孵育過夜。第2天棄去一抗，洗膜后，加入對應二抗(1：10 000)，室溫封閉1 h后，滴加發光液曝光顯影。以GAPDH為內參。

2 結果

2.1AG對膿毒癥大鼠心、肺組織病理損傷的影響 大鼠心肌組織HE染色結果如圖1所示。正常對照組大鼠心肌組織未見明顯病理變化，模型對照組大鼠可見心肌纖維排列紊亂、細胞核腫脹、部分心肌纖維斷裂、炎性細胞增多等病理改變，AG中劑量、大劑量組和利奈唑胺組大鼠心肌組織中上述病理改變均有不同程度的改善。

大鼠肺臟組織HE染色結果如圖1所示：正常對照組大鼠肺組織未見明顯病理變化，模型對照組大鼠可見肺泡塌陷，肺泡壁厚度增加，大量炎性細胞浸潤等病理學改變；AG中劑量、大劑量組和利奈唑胺組大鼠肺組織病理學改變均得到改善。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組。

2.2AG對膿毒癥大鼠心肌損傷標記物和肺臟W/D影響 ELISA檢測各組心肌組織勻漿中心肌損傷標記物含量，結果見圖2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠心肌組織勻漿中CK-MB、cTnI和Mb含量顯著增加(t=1.631，1.165，1.438，P<0.01)；與模型對照組比較，AG治療組上述指標均有不同程度的降低，其中AG中劑量、大劑量組降低程度差異有統計學意義(F=39.83，33.18，104.6，P<0.05或P<0.01)。

測定各組大鼠肺臟干燥前后兩次質量，檢測AG對膿毒癥大鼠肺臟W/D的影響，結果見圖2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠肺臟W/D顯著增加(t=4.744，P<0.01)；與模型對照組比較，AG治療組大鼠肺臟W/D均下降，其中AG中、大劑量組比值差異有統計學意義(F=38.11，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05，③與模型對照組比較，P<0.01。

2.3AG對膿毒癥大鼠炎癥因子表達的影響 ELISA檢測大鼠血清中炎癥因子表達水平，結果如圖3所示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2血清表達水平顯著上調(t=1.513，1.936，1.399，1.527，P<0.01)；與模型組比較，AG治療組中上述指標表達水平均明顯下調，且AG中劑量、大劑量組差異有統計學意義(F=80.93，8.498，38.38，13.99，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05，③與模型對照組比較，P<0.01。

2.4AG對膿毒癥大鼠心臟和肺臟組織中HMGB1、TLR4蛋白表達和NF-κB p65磷酸化水平的影響 Western boltting檢測大鼠心肺組織中HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平的影響，結果如圖4所示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠心、肺組織中HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平顯著上調(心臟：t=1.086，1.168，1.400；肺臟：t=1.142，1.130，1.138，P<0.01)；與模型對照組比較，AG治療組中上述指標表達水平均明顯下調，且AG中大劑量組差異有統計學意義(心臟：F=145.0，84.89，50.86；肺臟：F=52.28，76.15，26.80，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05，③與模型對照組比較，P<0.01。

2.5AG和(或)PDTC對膿毒癥大鼠心肺損傷、炎癥因子表達和信號通路活化的影響 HE染色、心肌損傷標記物和肺臟W/D檢測結果如圖5-A、B和C所示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠心臟組織可見明顯的排列紊亂、細胞核消融和炎性浸潤等病理改變，且心肌損傷標記物含量顯著上升(t=1.526，1.241，1.323，P<0.01)，肺臟組織也可見肺泡塌陷，肺泡壁厚度增加，炎性浸潤等病理學改變，且肺臟W/D也顯著增加(t=4.622，P<0.01)；與模型對照組比較，AG和/或PDTC治療組大鼠心肺組織病理學改變得到明顯改善，心肌損傷標記物含量和肺臟W/D也顯著下降(F=223.2，71.22，73.46，70.92，P<0.01)。

ELISA和Western boltting分別檢測炎癥因子和炎癥信號通路活化情況，結果如圖5-D、E和F所示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中炎癥因子和心肺組織中炎癥信號通路蛋白表達水平均顯著上調(t=1.404，2.138，1.413，1.511，1.234，1.154，1.504，1.294，1.432，1.390，P<0.01)；與模型對照組比較，AG和(或)PDTC治療組大鼠上述指標均顯著下調(F=165.0，15.69，60.34，39.39，37.37，55.11，25.89，79.17，41.54，82.05，P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.AG大劑量組；D.PDTC+模型組；E.PDTC+AG大劑量組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

上述結果均證明，AG改善膿毒癥大鼠心肺損傷和炎癥反應的機制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65信號通路活化有關。

3 討論

目前，關于AG在膿毒癥的治療研究尚不多，本文通過腹腔注射脂多糖5 mg·kg-1建立膿毒癥模型大鼠，并分3次于造模后立即、8 h和16 h給予AG治療，造模24 h后，取材進行檢測發現：模型對照組動物心臟和肺臟組織發生典型的膿毒癥病理學改變；同時，心肌損傷標記物含量明顯上升，肺部W/D也增加。結果表明本實驗膿毒癥模型建立成功。此外，小劑量AG治療后上述檢測指標未見明顯改變，中劑量、大劑量AG則有效改善了心臟和肺臟的病理損傷程度，降低了心肌損傷標記物釋放和肺臟W/D，其中大劑量組效果更優，僅次于利奈唑胺。綜合實驗結果，大劑量AG能有效治療LPS誘導的膿毒癥大鼠心、肺組織病理損傷。

研究表明，AG具有較強的抗炎作用，而多種疾病均與炎癥因子大量釋放有關[11，17]。巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)是白血病趨化因子家族之一，有助于中性粒細胞聚集到損傷或感染部位，從而調節免疫和炎癥反應，是炎癥反應的重要部分[18]。研究表明，急性肺損傷發生時，肺臟干濕比及肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平均發生改變[19]。研究發現，在膿毒癥小鼠模型中，AG能通過減少心肌細胞凋亡減輕脂多糖誘導的心臟功能紊亂[20]。本研究結果證明，AG治療能降低膿毒癥大鼠血清中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2)含量。

NF-κB是炎癥反應最重要的轉錄調節因子，磷酸化激活后可轉移到細胞核內，結合并啟動促炎基因表達和炎癥反應的擴增，從而導致炎癥損傷。因此，抑制NF-κB信號活化是治療炎癥性疾病的重要手段[21]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)可與內源性配體TLR4結合，使NF-κB磷酸化，激活HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，誘導炎性細胞因子的釋放，啟動炎癥級聯反應，造成組織損傷[22]。LIU等[11]研究發現，AG治療后，能減少脂多糖誘導的髓核細胞凋亡和炎癥遞質含量，其機制就與抑制NF-κB途徑密切相關。另一研究也表明，AG能抑制促炎細胞因子IL-1β對髓核細胞凋亡的誘導作用，同時NF-κB的核易位[16]。本研究發現，膿毒癥大鼠心臟和肺臟組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白水平均在AG治療后顯著降低。提示膿毒癥大鼠的心肺組織損傷和炎癥反應發生與該通路的表達上調有關，為了證明此觀點，觀察了NF-κB特異性抑制劑—PDTC[23]和(或)AG治療對上述檢測指標的影響，結果發現：PDTC能減輕膿毒癥大鼠心肺組織病理損傷、心肌損傷標記物釋放、肺臟W/D比值、血清炎癥細胞因子含量和HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路表達水平，而AG能增加PDTC的上述調節作用。

綜上所述，AG能改善心肺組織病理學改變，減少心肌損傷標記物含量，降低肺臟W/D比值，抑制血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2表達，抑制HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65表達水平，并能增加NF-κB特異性抑制劑PDTC對膿毒癥大鼠心肺組織損傷、心肌損傷標記物、肺臟W/D比值、血清炎性細胞因子含量及炎癥通路活化的調節作用?？傊珹G能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路活化，減輕膿毒癥大鼠心肺病理損傷和炎癥反應。