沒食子酸對鼻咽癌體外放射敏感性的影響*

林重華，楚婷，許美鳳，李路，師盼，舒易方，瞿家權，，

(1.吉首大學醫學院醫學影像技術系，湖南吉首 416000；2.重慶市黔江中心醫院腫瘤科，重慶 409000；3.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，重慶 400038；4.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院腫瘤科放療室，重慶 400038)

沒食子酸(gallic acid，GA)又稱為五倍子酸或棓酸，是一種具有多酚結構有機酸[1]，主要存在于五倍子、漆樹、金縷梅、茶葉、橡樹皮等植物中，藥用或工業提取沒食子酸的主要途徑是通過水解五倍子。五倍子藥材的有效成份主要是沒食子酸，具有抗氧化、抗菌和抗病毒作用，有較高畜牧水產養殖和藥用開發價值[2]。小劑量沒食子酸抑制ras癌基因信號活化和免疫調節的作用，但其抗腫瘤作用具體機制不明[3-4]。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方地區高發的頭頸部惡性腫瘤，以低分化未分化癌為主要組織學類型，對放化療均敏感[5]。放射治療完全緩解后腫瘤復發和遠處轉移是晚期鼻咽癌治療棘手的問題，獲得性放療抵抗被認為是鼻咽癌復發和轉移的關鍵影響因素[6]。因此，本研究采用放療增敏藥物篩選模型檢測沒食子酸對鼻咽癌細胞增殖和體外放療敏感性影響，并初步探討沒食子酸增加放療誘導的腫瘤細胞殺傷作用的分子機制，為進一步定向篩選放療協同增效候選化學實體和天然多酚和黃酮類抗腫瘤分子靶點研究提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1受試物 沒食子酸一水合物(貨號：398225)購于Sigma-Aldrich公司，含量≥98.0%，符合美國化學協會標準。沒食子酸一水合物用磷酸鹽緩沖液溶解后，經0.45 μm無菌濾器過濾，配制成母液濃度為500.0 μmol·L-1的溶液，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2細胞 人鼻咽癌細胞系HNE-1從中南大學湘雅醫學研究中心購買，10%胎牛血清RPMI-1640完全培養基(HyClone公司，貨號：SH30809.01)，置于5%二氧化碳恒溫37 ℃細胞培養箱，常規消化傳代，對數生長期制成單細胞懸液備用。放療抵抗鼻咽癌細胞株參考文獻[7]采用深部X射線多分次亞致死劑量暴露法構建。本研究采用的放療抵抗HNE1-IR和對照組放療敏感HNE1細胞株均為多輪亞致死照射后4～15傳代并通過下文的放射克隆存活法鑒定。

1.1.3試劑 RPMI-1640培養基(HyClone公司，貨號：SH30809，01)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司，批號：04-121-1A)；胰蛋白酶、RIPA細胞裂解液、Hoechst33258熒光染料溶液、0.5%結晶紫染料購于碧云天生物技術有限公司(批號：C0203，P0013K，C1018，C0121)；Annexin V-FITC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD Biosciences公司，貨號：556547)，噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)均為美國Sigma公司(貨號：M2128，472301)；蛋白酶和磷酸化酶抑制劑為美國Roche公司(貨號：4693159001，4906837001)；β-actin和程序性死亡配體1(programmed dealth-ligand 1，PD-L1)人單克隆抗體，抗兔和抗鼠二抗均為美國Santa Cruz公司(貨號：sc-8432，sc-293425，sc-2357，sc-516102)，STAT3和STAT3(Tyr705)位點磷酸化和c-Jun(Ser63)位點磷酸化單克隆抗體為美國CST公司(貨號：#12640，#9145，#91952)。

1.1.4儀器 雙目倒置相差顯微鏡，日本Olympus，CKX41型；二氧化碳細胞培養箱，美國Thermo Fisher，Forma Serises 3 Water Jacketed型；雙目倒置熒光顯微鏡，日本Olympus；酶標儀(iMark型號)，美國Biorad有限公司；6～10 MeV，雙光子射線，Varian Clinac 2100 C/D醫用直線加速器為美國Varian公司產品。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對數生長期HNE1和HNE1-IR細胞，以每孔約1000個HNE1-IR細胞/180 μL接種于96孔培養板中，分別加入20 μL沒食子酸工作液(母液濃度為40 mmol·L-1)，使其終濃度分別為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0 μmol·L-1，溶媒對照組每孔加入20 μL PBS溶液的完全培養基，采用順鉑(DDP)作為陽性對照組(終濃度為10.0 μmol·L-1)；每組設5個復孔，分別培養48和72 h。終濃度2.5 μmol·L-1沒食子酸給藥預處理HNE1和HNE1-IR細胞24 h后，聯合分割放療(DT：4Gy，2Gy/F，1F/d×2)后繼續培養24和48 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT液20 μL，測定細胞抑制率并擬合曲線獲得半數抑制濃度(IC50)，實驗重復3次。

1.2.2Hoechst染色凋亡檢測法 取對數生長期HNE1和HNE1-IR細胞，以每孔約10 000個細胞接種于6孔板中，完全培養基細胞接種過夜后，次日開始給予單劑量的2.5 μmol·L-1沒食子酸聯合分割放療(DT：6 Gy，1.2 Gy/F，1F/d×5)處理細胞，對照組細胞給予假照射處理，繼續培養24 h，收集貼壁細胞，多聚甲醛冰上固定30 min，5 μg·mL-1Hoechst 33258溶液重懸細胞避光孵育10 min，離心洗滌后，再重懸細胞制備細胞涂片，熒光顯微鏡下觀察典型的凋亡細胞在形態學上可出現染色質固縮，核碎裂以及核發泡等改變。凋亡細胞百分比計算方法為：在6個隨機顯微鏡視野下選取細胞400個計算其中的凋亡細胞數目，重復3次。

1.2.3流式細胞術7-AAD/Annexin V-FITC雙染色凋亡檢測法 取對數生長期細胞，以每孔約10 000個細胞接種于6孔板中，完全培養基細胞接種過夜后，次日開始給予單劑量的2.5 μmol·L-1沒食子酸聯合分割放療(DT：6 Gy，1.2 Gy/F，1F/d×5)處理細胞，對照組細胞給予假照射處理，繼續培養24 h，收集貼壁細胞，按Annexin V-FITC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明如下：加入Annexin V-FITC染色液5 μL，避光孵育15 min，隨后加入7-AAD染色液5 μL后輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，上機采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復3次。

1.2.4放射克隆存活實驗 常規6孔培養板按3種細胞密度接種(每孔500，1000，2000個)，待細胞貼壁后，培養板上層覆蓋補償膠1.0 cm，皮源距100 cm，等中心照射，劑量深度2.5 cm，劑量建成區野與6孔板細胞的投影面積重合，吸收率為200 cGy·min-1，分別暴露于0(燈光野假照射)，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 Gy的梯度劑量的X-射線下(6 MeV，X-射線，Varian Clinac 2100直線加速器)，照射后靜置于細胞培養箱中繼續培養14～18 d，0.5%結晶紫染色，細胞50個以上克隆計數。按公式計算：克隆效率=存活克隆數/接種細胞數，生存分數=克隆效率處理組/克隆效率對照組，其中0 Gy射線暴露為對照組。采用GraphPad Prism 5.0版軟件，按照線性二次方程模型S=e-αD-βD2擬合劑量反應曲線，其中S為生存分數，α和β為常數，D為劑量，計算存活曲線下面積(area under the curve，AUC)和放射保護因子(radiation protection factor，RPF)，重復3次。

1.2.5免疫印跡法 處理細胞加蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，于冰上裂解30 min，4 ℃，10 000×g離心20 min，吸取上清液，BCA 法蛋白定量，常規煮沸變性5 min，樣品蛋白上樣量為每泳道30 μg，10% SDS-PAGE 變性凝膠電泳，電泳條件：積層膠50 V，分離膠120 V恒定電壓電泳分離，電轉移條件：采用恒定電流(100 mA，1.5 h)至厚度0.22 μm PVDF 膜上。5%脫脂牛奶在室溫下封閉1～2 h，孵一抗4 ℃過夜，β-actin抗體濃度為1：5 000，PD-L1抗體濃度為1：500，STAT3和磷酸化STAT3抗體及磷酸化c-Jun濃度均為1：1 000，室溫下孵二抗(1：5 000)1.5 h，加發光劑后壓片(3～15 min)，顯影定影(3～5 min)，采用Alpha Image圖像分析系統對膠片掃描分析。

2 結果

2.1放療抵抗的鼻咽癌細胞株篩選及鑒定 放射克隆存活實驗分析鼻咽癌細胞放療敏感性結果顯示，與放療敏感HNE1細胞株比較，HNE1-IR細胞株放療敏感性顯著降低[AUC(HNE1-IR)2.119vs.AUC(HNE1)1.491，P<0.05；放射保護因子=1.421](圖1)。

2.2沒食子酸對鼻咽癌細胞放療敏感性的影響 沒食子酸對鼻咽癌HNE1-IR和HNE1細胞株的增殖具有抑制作用，其IC50值分別為12.58和11.17 μmol·L-1。單純放療對HNE1-IR和HNE1細胞株抑制率分別為：(66.2±8.4)%，(79.3±8.4)%，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2 B)；而2.5 μmol·L-1沒食子酸同期聯合放療對HNE1-IR和HNE1細胞株抑制率分別為：(87.3±5.1)%，(91.3±6.4)%，差異無統計學意義(P>0.05)。放射克隆存活實驗線性二次方程靶模型結果顯示，與對照組HNE1細胞比較，沒食子酸聯合放療處理HNE1-IR細胞線性二次方程擬合克隆存活曲線下面積差異值顯著增加[AUC(HNE1-IR+GA)1.726vs.AUC(HNE1+GA)1.341，ΔAUC(HNE1-IR+GA)0.393vs.AUC(HNE1+GA)0.150，t=2.714，P<0.05](圖2A)。上述結果提示，小劑量沒食子酸可能具有非依賴細胞毒的鼻咽癌體外放療增敏作用。

A.線性二次模型擬合放射存活曲線及曲線下面積差值比較沒食子酸對放療增敏作用的影響；B.平皿培養18 d沒食子酸聯合放療4 Gy處理對不同放療敏感性的鼻咽癌細胞存活克隆染色數量和大小比較。

2.3沒食子酸聯合放療處理對鼻咽癌細胞凋亡的影響 為了進一步分析單純放療或同期聯合沒食子酸對鼻咽癌細胞凋亡的影響，本研究采用Hoechst染色凋亡檢測法分析細胞凋亡形態學改變，結果證實，與對照組比較，2.5 μmol·L-1沒食子酸同期聯合放療處理HNE1-IR細胞凋亡率的差值顯著增加[Δ凋亡率(HNE1-IR+GA+RT)-(HNE1-IR+GA)=14.2%vs.Δ凋亡率(HNE1+GA+RT)-(HNE1+GA)=6.1%，t=4.799，P<0.05](圖3C)。相似地，流式細胞凋亡檢測法分析結果證實，與對照組HNE1細胞株比較，2.5 μmol·L-1沒食子酸同期聯合放療處理HNE1-IR細胞凋亡率的差值顯著增加[Δ凋亡率(HNE1-IR+GA+RT)-(HNE1-IR+GA)=13.7%vs.Δ凋亡率(HNE1+GA+RT)-(HNE1+GA)=10.3%，t=2.231，P<0.05](圖3D)。上述結果提示，沒食子酸通過誘導細胞凋亡，增加鼻咽癌細胞株的放療敏感性。

A.典型的Hoechst染色熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態學改變，白色箭頭顯示典型的凋亡形態學改變高染色的核固縮、核碎裂、核邊集等改變；B.流式細胞術雙熒光染色分析鼻咽癌細胞凋亡形態學改變；C.Hoechst染色熒光顯微鏡觀察比較各組細胞凋亡率差異；D.流式細胞術雙熒光染色比較各組細胞凋亡率差異。①與HNE1比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.01。

2.4沒食子酸聯合放療處理對鼻咽癌細胞STAT3和c-Jun信號活化及PD-L1蛋白表達水平的影響 為分析低濃度沒食子酸增加鼻咽癌細胞株放療敏感性的分子機制，本研究采用免疫印跡法分析了沒食子酸對放療誘導的細胞信號傳導和免疫檢查點抑制分子的影響，結果證實，與對照組比較，低濃度沒食子酸聯合放療處理顯著下調HNE1-IR細胞株STAT3和c-Jun磷酸化水平，但并不能完全逆轉放射線誘導的HNE1-IR細胞PD-L1蛋白表達上調。結合上述結果提示，沒食子酸聯合放療處理可能部分抑制鼻咽癌細胞STAT3和c-Jun信號活化，但不影響放療誘導的腫瘤免疫檢查點負調控PD-L1蛋白水平的表達，見圖4。

A.典型的免疫印跡圖片比較鼻咽癌細胞STAT3和c-Jun信號磷酸化和PD-L1表達水平；B.半定量分析鼻咽癌細胞STAT3，c-Jun活化水平和PD-L1表達水平；①與HNE1-IR/RT+vehicle比較，P<0.01。

3 討論

放射治療(radiotherapy，RT)是包括鼻咽癌在內的頭頸部腫瘤的首選和基礎性的治療措施[5]。鼻咽癌放療后病灶中殘留生存的腫瘤細胞可復發和遠處轉移，最終導致治療失敗，已成為制約鼻咽癌療效改善的瓶頸[6]。目前暫無作為A類證據用于鼻咽癌臨床治療的非細胞毒放療增敏劑，且少數幾種其他腫瘤放療增敏的候選藥物也處于臨床前評估階段[7]。因此，定向測試放療增敏的候選化學實體，篩選高效低毒的放療增敏候選藥物，特別是低細胞毒藥物可與目前放療和(或)免疫治療藥物聯用，對克服腫瘤放療抵抗和改善鼻咽癌療效具有臨床價值[8]。本研究通過定向篩選策略和放療體外模型初步證實，沒食子酸具有鼻咽癌體外放療增敏作用，放療增敏的分子機制可能是通過抑制STAT3和c-Jun信號活化而并不阻斷PD-L1蛋白水平表達，增加放射性誘導的細胞凋亡，上述結果為進一步篩選并鑒定潛在放療增敏劑的研究提供依據。

本研究成功構建放射敏感性差異的2株鼻咽癌細胞模型。常規分割放療或亞致死性分割放療，可通過健存腫瘤細胞加速再群化(repopulation)在放療間期使部分腫瘤細胞亞群呈現快速增殖狀態，從而誘導出放療抗拒的亞克隆，最終使腫瘤產生獲得性放療抵抗[9]。因此，放射生物學基礎研究通常模擬臨床的分割放療模式，采用多輪亞致死放療暴露法篩選出放療抵抗的腫瘤細胞株，進而構建放療抵抗細胞模型。本研究也采用此類模型并通過隨后實驗證實，低濃度沒食子酸(2.5 μmol·L-1)對2株放療反應性不同的鼻咽癌細胞具有相似的細胞毒作用，沒食子酸對放療抵抗HNE1-IR細胞的增敏效應高于放療敏感細胞株HNE1；沒食子酸增加放療誘導的凋亡效應也高于放療敏感細胞株HNE1。上述結果提示，低濃度沒食子酸可能具有非依賴細胞毒的放療增敏作用。研究提示，黃酮和多酚類的放療增敏[10]可能與細胞毒非依賴性作用相關。本研究所報道的小劑量沒食子酸具有鼻咽癌細胞體外放療增敏作用與上述報道類似。

一般而言，放射線及其誘導產生的活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)損傷DNA等生物大分子，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮放射治療作用[11]。亞致死劑量放射線在誘導分割放療獲得性的腫瘤放療抵抗相關[12]，通過激活健存腫瘤細胞自身防御功能和細胞生存信號通路包括NF-κB信號通路、STAT3信號通路和PI3K/AKT信號通路，進而誘導DNA損傷修復能力增強而對抗放射線殺傷。本研究分析單純放療或同期聯合沒食子酸處理對鼻咽癌細胞增殖、存活、免疫檢查點信號分子表達的影響，結果證實，低濃度沒食子酸可顯著阻斷放療抵抗鼻咽癌細胞STAT3信號活化。提示，沒食子酸可能通過抑制STAT3信號活化，調控亞致死劑量放射誘導的細胞生存信號，發揮非細胞毒放療增敏效應。此結果與大量的關于STAT3信號通路活化參與頭頸部鱗癌和鼻咽癌獲得性放化療抵抗研究一致，而STAT3也可能是沒食子酸放療增敏作用的潛在分子靶點。同樣的，根據鼻咽癌組織和正常鼻咽上皮表達譜芯片在公共數據庫的表達差異分析研究的線索[13]，促生存和抑制凋亡的信號通路和轉錄因子調控網絡節點分子c-Jun可能作為腫瘤的生物標志物。本研究證實，沒食子酸聯合放療處理下調鼻咽癌細胞磷酸化c-Jun信號。國內其他研究組采用裸鼠人鼻咽癌細胞移植瘤模型結果[14]與本研究的結果一致，抑制c-Jun表達或采用基因沉默方式敲低c-Jun表達可抑制放射抵抗鼻咽癌移植瘤的生長及血管生成。因此，c-Jun作為多種轉錄因子網路系統節點分子可能參與沒食子酸對鼻咽癌細胞放療增敏過程。腫瘤免疫治療被認為是克服放療抵抗的一種有效策略，腫瘤組織高表達PD-L1是免疫治療療效預測的重要標志物[15]。普通分割放療和免疫治療聯用的臨床前數據和早期披露的臨床試驗數據存在分歧，一方面，亞致死劑量放療可促進暴露的腫瘤組織釋放新抗原，甚至可觀察到腫瘤免疫激活和放療遠隔效應(abscopal effect)[16]，發揮免疫治療增效作用；另一方面，亞致死劑量放療誘導細胞STAT3信號活化，誘導PD-L1表達上調[17]，抑制效應T淋巴細胞免疫殺傷作用，促進腫瘤發生免疫逃逸。本研究結果初步證實，低濃度沒食子酸并不抑制亞致死劑量放療誘導的PD-L1蛋白表達水平上調。然而，沒食子酸是否協同免疫治療增效作用以及是否協同效應T細胞腫瘤的免疫殺傷作用，仍需要采用免疫治療和放療體內外模型進一步驗證。

綜上所述，本研究初步證實小劑量沒食子酸可能抑制鼻咽癌細胞STAT3和c-Jun信號活化，增加放射線誘導的細胞凋亡，發揮細胞毒非依賴性的放療增敏作用。沒食子酸抑制STAT3活化但并不阻斷PD-L1蛋白水平，可與鼻咽癌綜合治療策略聯合，發揮協同增效作用的潛力。