新型冠狀病毒檢測試劑質量把控要點

【作 者】鄧敏

上海市醫療器械檢驗研究院，上海市，201318

0 引言

2019年12月以來，湖北省武漢市出現新型冠狀病毒肺炎疫情，隨疫情蔓延，我國其他地區及境外多個國家也相繼發現此類病例。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理[1]。2020年2月11日，世界衛生組織將新型冠狀病毒肺炎命名為COVID-19，國際病毒分類學委員會的冠狀病毒研究小組建議把新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2（嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒）[2]。新型冠狀病毒屬于β屬的冠狀病毒，基因組為線性的單股正鏈RNA，是已知可感染人類的第7種冠狀病毒[3]，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm[1]。可引起人類呼吸道感染，其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征（SARS）相關冠狀病毒和中東呼吸綜合征(MERS)相關冠狀病毒有明顯區別，基因組序列約由29 kb堿基對構成，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白[4]。此次由SARS-CoV-2引起COVID-19疫情具有傳染性強、傳播迅速等特點，對該病毒進行快速、準確的實驗室檢測有利于有效控制疫情發展及對病患的及時診治。疫情爆發以來，由于時間緊迫，研發任務緊急，已上市的產品存在質量上的不足。為提升試劑產品的性能，以便其更好地在疫情防控中發揮作用，本研究結合注冊檢驗過程中發現的問題，從檢驗角度著重分析可能影響產品性能和質量的把控要點，并提出相關建議，為今后SARS-CoV-2實驗室檢測試劑的研發工作提供參考與思路。

1 新型冠狀病毒肺炎的實驗室檢測方法

目前，針對新型冠狀病毒肺炎的實驗室檢測方法主要分為病原學方法及血清學方法。病原學檢測主要為核酸檢測法，檢測原理是檢測患者體液樣品中SARS-CoV-2特異性RNA序列。目前上市的核酸檢測試劑均采用新型冠狀病毒基因組中ORF1ab、E蛋白和N蛋白進行選擇。不同產品的檢測原理基本一致，主要區別在于其設計的引物和探針，二重檢測的靶基因主要是雙靶區段（ORF1ab、N基因）、三重檢測的靶基因主要是三靶區段（ORF1ab、N基因和E基因）。核酸檢測方法包括基因測序法、實時熒光定量PCR法、微滴式數字PCR法和恒溫擴增芯片法等技術。最常用的是實時熒光PCR法，具有高特異性、高靈敏度的特點，是一種快速、成本較低且已在臨床廣泛使用的感染性病原體核酸檢測技術。對實驗室人員的操作能力、儀器設備要求較高。

血清學方法檢測原理基于免疫學抗體檢測，是檢測新型冠狀病毒進入人體后所產生的特異性抗體。方法包括：免疫層析法、酶聯免疫吸法及化學發光免疫分析法等。已上市的抗體檢測試劑主要針對檢測抗體IgM、抗體IgG及總抗體。抗體IgM是機體受到病原體的攻擊后人體初次體液免疫應答出現的抗體，是最先產生并迅速到達峰值的抗體，可用于早期診斷。抗體IgG產生較晚，但在血清中濃度較高、親和力水平高，存在時間久，即使患者恢復后其濃度仍可保持較高水平，可被用于提示感染處于中后期或既往感染。與核酸檢測相比，病毒抗體檢測對臨床實驗室的操作要求相對要低，而且抗體血清學檢測的樣本來源于外周血、血清或血漿，具有良好的穩定性，從而可以提高檢測的敏感度。且血液樣本更易獲得，采集操作簡單快速，降低了醫護人員在樣本采集和檢測過程中被感染的概率。抗體檢測具有速度快、通量高的特點，更易于在基層實驗室進行。但在人群流行率總體很低的情況下，病毒抗體檢測不適用于大面積復工、復產、復學等普通人群的篩查工作，也不適用于在低流行地區進行流行病學的調查[5]。

核酸檢測病毒的RNA，是病毒存在的直接證據，而機體感染病毒后產生體液免疫應答，產生的抗體就是病毒存在間接證據，可以判斷患者是否近期或既往感染過2019新型冠狀病毒。國家衛生健康委員會（衛健委）組織專家制定前六版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中都以病原學方法，如實時熒光RT-PCR檢測和病毒基因測序作為診斷標準。而在2020年3月3日衛健委發布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》（以下簡稱《診療方案第七版》）中明確指出診斷標準在原有病原學方法基礎上，又增加“血清學檢查”作為診斷新型冠狀病毒肺炎判定的依據，即“血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性”或“血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍以及以上升高”也可確診[1]。《診療方案第七版》中也增加疑似病例排除標準，即疑似病例排除必須滿連續兩次新型冠狀病毒核酸檢測陰性（采樣時間至少間隔24 h），且發病7 d后的新型冠狀病毒特異性抗體IgM和IgG仍然陰性[1]。病毒核酸檢測仍然是新型冠狀病毒肺炎確診感染的“金標準”，而抗體檢測可以作為病毒核酸檢測的有效補充。

2 2019新型冠狀病毒檢測試劑盒上市情況

截至2020年7月16日，已有44個新型冠狀病毒檢測試劑盒經國家藥監局審批上市，均為定性檢測試劑。基于病原學檢查的新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑盒共計23個，其中16個熒光PCR法試劑、1個聯合探針錨定聚合測序法試劑、1個恒溫擴增芯片法試劑、1個雜交捕獲免疫熒光法試劑、1個恒溫擴增-實時熒光法試劑、1個RNA捕獲探針法試劑、1個RNA恒溫擴增-金探針層析法試劑及1個雙擴增法試劑。新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測試劑盒共計21個，其中包括8個免疫層析試劑、11個化學發光法試劑、1個量子點熒光免疫法試劑、1個酶聯免疫法試劑。

3 2019新型冠狀病毒檢測試劑盒產品性能質量控制要點

2020年2月8日，科技部發布《科技部關于發布新型冠狀病毒(2019-nCoV)現場快速檢測產品研發應急項目申報指南》（后簡稱《申報指南》），面向社會征集更加快速、便捷、準確的新型冠狀病毒的現場快速檢測產品。企業紛紛響應國家政策號召，積極參與到SARSCoV-2檢測試劑的研發生產活動中來。但由于SARS-CoV-2是新發病毒，故在研發生產過程中存在諸多難題，如：時間緊迫、相關技術把控要點掌握不到位以及較難獲得足夠量的臨床樣本等。2020年2月12日，醫療器械技術審評中心發布了《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點（試行）》（簡稱《核酸審評要點》），并在13 d后發布了《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊技術審評要點（試行）》（簡稱《抗體審評要點》）。依據《審評要點》及其他已發布的相同方法學相關行業標準，結合檢驗過程中發現的問題，建議企業對研發過程中可能影響產品性能和質量的要點應予重點關注，如：陽性判斷值確定、最低檢測限確定與驗證、交叉反應、精密度檢測方法、企業參考品的設置與制備、不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗證、內源/外源物質干擾驗證及血液樣本滅活方式等。

3.1 核酸檢測試劑性能質量控制要點

3.1.1 陽性判斷值確定資料

由于目前該類試劑盒沒有計量學溯源性，所以確定資料主要是指對申報產品病毒核酸檢測的Ct值（結果判斷的臨界值）進行確認的資料。資料中樣本來源應考慮盡可能多的因素，并選取具有代表性的樣本。對所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，灰區建立的基礎、閾值設置的科學合理性進行闡述和驗證。

3.1.2 最低檢測限的確定及驗證

最低檢測限的確定及驗證是評價產品性能的重要環節。因目前新型冠狀病毒核酸檢測試劑國家參考品均無量值定值，故企業在研發過程中無法通過國家參考品進行量值溯源，這就需要企業對最低檢測限進行合理設定及驗證。在進行最低檢測限的確定時，應至少包含不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒的真實臨床樣本或含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒，用適當基質進行系列梯度稀釋，在最低檢測限濃度水平進行驗證，結果應達到90%～95%陽性檢出率。采用科學的方法標定病毒滴度，進行最低檢測限相關的量值研究，并且提供詳細的病毒液滴度的驗證結果。

3.1.3 交叉反應驗證

交叉反應實驗可以直接反應出試劑特異性方面的性能，特異性高的試劑可以減少假陽性樣本的出現。試劑需在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。《核酸審評要點》中列舉了約50余種病毒和細菌種類，企業如無法獲得全部種類的樣本，建議至少在冠狀病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7個大類別中分別挑選代表病毒或細菌樣本進行驗證。其中對于難以獲得真實樣本的類型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等相關資料。

3.1.4 精密度檢測方法

《核酸審評要點》中要求精密度性能驗證需要多個臨床樣本，除模擬樣本外，同時應包含若干臨床樣本，至少包含陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品。精密度評價試驗及注冊檢驗過程中應包含核酸分離/純化步驟。重復性參考品中應包括高、低兩個濃度的樣本，其中低濃度應為最低檢出限附近的濃度。

3.1.5 企業參考品的設置與制備

2020年4月16日，中國食品藥品檢定研究院標準物質和標準化管理中心發布了《注冊檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品目錄（第八期）》，目錄中增加了6個新型冠狀病毒抗體、抗原及核酸檢測試劑相關的國家參考品，此批應急用國家參考品可用于評估各申報試劑的性能，但沒有公布量值及計量溯源。

各企業應根據產品性能的實際情況，同時參照中國食品藥品檢定研究院的新型冠狀病毒核酸檢測試劑國家參考品設置企業內部參考品的項目及內容，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復性參考品，且應不低于國家參考品要求。其中，陽性參考品應至少選取不同來源、不同滴度水平的5個病毒樣本。陰性參考品則主要包含對交叉反應進行驗證的樣本。檢測限參考品的濃度水平可等于或略高于最低檢測限的水平。企業應對內部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的試驗驗證，并提交詳細的方法、使用試劑、具體數據結果等驗證資料。除SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒可采用假病毒外，參考品應均為臨床真實樣本。

3.1.6 不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗證

目前有多種樣本類型，拭子材質、采集方法、樣本采集量和采樣時機等都與病毒載量密切相關，可直接影響到試劑的檢出率。《診療方案第七版》中，明確病原學檢查樣本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、糞便等標本[1]。《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》中將標本采集種類做了進一步的細化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本、眼結膜拭子及便標本，并對不同類型的樣本分別有相應的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯防聯控機制醫療救治組發布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測》中，規定原則上不超過5個的咽拭子進行充分混合，形成混合待檢樣本。面對種類眾多的樣本類型，且包括混合樣品，這就需要企業對于上述所有樣本類型的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取純度等，有針對性地對樣本的滅活/液化、加樣體積和模板洗脫體積做研究驗證，明確說明具體操作過程，并提供詳細的驗證資料。若提取過程中涉及配套使用的自動核酸提取儀，企業還需要提供核酸提取儀的相關注冊證書、儀器使用說明書及配套提取試劑盒的使用說明書。從而確保檢測體系具有可控性，提高試劑靈敏度，降低假陰性結果的出現，保證檢測過程順利進行。

3.2 抗體檢測試劑性能質量控制要點

抗體檢測質量控制要點與核酸檢測基本一致，但考慮抗體檢驗容易受到樣本溶血、纖維蛋白、細菌污染或患者自身抗體等因素的影響，容易造成假陽性。因此，內源/外源物質干擾驗證及血液樣本滅活方式對試劑的影響也需要企業進行合理驗證。據薛雄燕等[7]報道，采用熒光免疫分析法檢測SARS-CoV-IgM，滅活前結果為陰性的標本，滅活處理后所有檢測結果均為陽性，陰性符合率為0，表明此方法不可采用56 ℃、30 min滅活處理后的樣本進行檢測。說明不同的滅活方法會影響抗體檢測結果，企業應在試劑說明書中寫明樣本滅活方法，并加以驗證。對于同時可檢測IgM、IgG兩種抗體的檢測試劑盒，企業陽性參考品制備時要注意合理均勻分配兩種抗體陽性樣本的比例，且應包含有IgM、IgG兩種抗體陽性的樣本，也包含有IgM、IgG單獨抗體陽性的樣本。

4 建議

2019新型冠狀病毒肺炎疫情的突發是對企業的研發能力、生產能力的一場巨大考驗，也是對臨床實驗室的檢測能力、安全防范的一次極大挑戰。疫情在全球范圍內蔓延造成了對SARSCoV-2檢測試劑的巨大需求，研發生產出更加快速、便捷、準確的SARS-CoV-2檢測試劑成為各個廠家研發的目標。疫情初期，對實驗室檢測結果出現假陽性、假陰性的質疑聲不絕于耳，但檢測過程中的各個環節都會影響檢測結果的準確度，如：試劑質量、采用方式、樣品質量、操作人員、儀器性能等。應急研發生產的試劑在質量方面可能存在差異，仍有待進一步進行驗證及比對。但各個檢測實驗室應根據自身具體情況，制定建立完整、合理和科學的技術操作規程、生物安全防護管理制度、結果質量保證措施及結果報告的規范等，同時應對檢測人員進行嚴格的培訓與考核。各個檢測實驗室應針對不同儀器、人員、方法和試劑開展室間質評實驗比對活動，確保最終結果的準確性和可靠性，以便更好地指導臨床診療工作。在注冊檢驗及審批過程中應加強質量把控，保證檢驗質量，提高檢驗效率，確保檢驗結果的準確可靠，從而確保上市產品的質量。隨著技術的發展與研究的深入，病毒檢測技術與方法日趨成熟完善，SARS-CoV-2檢測試劑會更好地服務于臨床，為做好常態化疫情防控工作提供強有力技術支撐。