體外診斷試劑陽性判斷值或參考區間研究解析

【作 者】徐超，劉容枝

國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心，北京市，100081

0 引言

體外診斷試劑的臨床應用在于通過對患者樣本的檢測實現對疾病的預測、預防、診斷、治療監測、預后觀察（判斷）和健康狀態評價。產品檢測結果的正常與否需通過其陽性判斷值或參考區間進行判定，因此，陽性判斷值或參考區間是產品不可或缺的屬性。陽性判斷值或參考區間在臨床檢驗活動中的作用相似，但又存在差異，陽性判斷值側重于對檢查對象的某種疾病狀態的判定，而參考區間在我國又被稱為“參考范圍”“正常范圍”“正常值”等，其側重于提示檢查對象是否“正常”。

1 概述

陽性判斷值為臨床上認識疾病程度及決定處理措施時的某一檢驗項目的分界值。它是臨床醫生處理患者的“閾值”，當檢測結果高于或低于某個陽性判斷值時，醫生應結合患者臨床癥狀做出相應的臨床決策，可對疾病排除或確認，或對疾病分級，或評估預后，或提示應采取措施處理[1]。例如：風疹病毒IgM抗體檢測試劑盒，檢測結果大于該產品陽性判斷值，可對患者進行風疹病毒感染的輔助診斷；過敏原特異性IgE檢測試劑，檢測結果大于該產品的陽性判斷值，可對患者過敏性疾病進行輔助診斷。因檢測結果可能受多種因素的干擾，且每一個陽性判斷值的設定，均導致產品具有特定臨床靈敏度與臨床特異性，所以檢測結果顯示陽性，并不一定代表檢測對象患病或處于某種疾病狀態，應結合患者具體信息進行分析。

參考區間為某一標志物在正常（健康）人群中的測量值范圍，是臨床醫生區別患者“正常”與“非正常”的標準，參考區間一般不同于疾病的輔助診斷[2]。例如鐵蛋白檢測試劑盒，檢測結果低于參考區間，可提示檢測對象可能存在缺鐵性貧血、妊娠等；檢測結果高于參考區間，可提示檢測對象可能存在原發性血色病、炎癥或感染、慢性肝病等。參考區間不同于陽性判斷值，其建立過程依賴于參考人群，并未納入某種特定疾病的患病人群，因此參考區間往往不針對某一種疾病。

基于陽性判斷值與參考區間的差異，生產企業在進行相關研究時，應充分考慮產品的預期用途、方法學及檢測標志物在人體正常與疾病狀態下的存在情況等因素選擇研究方法。同時已上市的同類產品選擇的是陽性判斷值還是參考區間對于生產企業確定此項研究也可提供重要參考。

2 國內外現狀

國際上醫療器械監管機構在體外診斷試劑上市前審評過程中對產品的陽性判斷值及參考區間的研究資料均有要求，國際醫療器械監管者論壇（IMDRF）發布的《醫療器械和體外診斷試劑安全和性能的基本原則》[3]，針對體外診斷試劑明確提出了有關陽性判斷值及參考區間的要求。

在我國體外診斷試劑注冊過程中，生產企業應提交其產品的陽性判斷值或參考區間的研究資料。根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求，將產品陽性判斷值或參考區間載明于產品說明書中，并簡要說明陽性判斷值或參考區間的確定方法。在產品注冊證有效期內，產品陽性判斷值或參考區間可隨著后續研究或參考文獻的更新而發生相應變化。如產品陽性判斷值或參考區間變化，同時產品具有新的臨床診斷意義，則此類變化不在體外診斷試劑變更注冊范疇之內。

3 陽性判斷值及參考區間的建立

3.1 陽性判斷值的建立

陽性判斷值作為體外診斷試劑的一個重要屬性，其建立過程應在完成產品前期研發且產品定型以后。任何體外診斷試劑在臨床應用過程中均存在一定臨床靈敏度與臨床特異性，理論上不存在靈敏度與特異性均為100%的產品，因此生產企業應綜合產品預期用途，在充分考慮產品臨床靈敏度與臨床特異性的基礎上，采用合理的方法建立陽性判斷值。受試者工作曲線（ROC曲線）是建立產品陽性判斷值的常用方法之一[4]。ROC曲線即以靈敏度為Y坐標，1-特異性即假陽性率為X坐標作圖得到的曲線，通過ROC曲線，可觀察靈敏度與特異性之間的關系。一般來說，靈敏度增高，則特異性降低，反之亦然。如研究者預期獲得綜合靈敏度與特異性最優的結果，則將ROC曲線上最靠近左上的一點作為產品陽性判斷值，這一點對應的靈敏度與特異性即為產品的性能。

研究者通過ROC曲線進行陽性判斷值的研究過程中，應重點考慮產品陽性判斷值與產品預期用途的適應性，如某些篩查用產品，其臨床應用過程中不期望有過多的檢測對象被漏診，此類產品陽性判斷值設定過程中應適當考慮在其特異性滿足要求的前提下，盡量提高其靈敏度，如某些臨床用于確認的產品，其臨床應用過程中不期望有過多的檢測對象被錯誤的報告為陽性，此類產品陽性判斷值設定過程中應考慮其靈敏度滿足要求的前提下，盡量提高其特異性。

研究者通過ROC曲線進行陽性判斷值研究過程中，應注意研究過程的科學嚴謹。第一，研究過程中，應同時入組患病人群（疾病組）與正常人群（正常組），兩組人群的病例數應滿足統計學要求[5]；第二，在疾病組入組過程中，相應入組人群及樣本類型應與產品預期用途一致，同時入組人群應考慮性別、年齡等因素；第三，患病人群的納入應連續，連續納入應考慮疾病不同的進程，如：極早期、早期、中期、晚期等，保證每階段均有一定的病例數量；第四，研究過程中應采用疾病診斷金標準或其他公認的診斷標準對入組的病例是否患病進行確認，必要時應對入組患者進行跟蹤隨訪，當有些診斷標準是有創性的，如穿刺活檢等，此類標準從倫理上講不能用于正常人群未患病的確認，那么針對正常人群需進行跟蹤隨訪以確認是否患病；第五，某一標志物可能對應多個臨床適應癥，針對不同臨床適應癥應分別進行陽性判斷值的研究；第六，研究過程中應有相應質量控制，以保證研究結果的準確可靠[6]。以上僅是對ROC曲線研究過程中應重點關注的內容進行概述，因為此項研究影響因素較多，研究者應從產品自身實際出發，設計合理的研究方案。

案例分析：miR-92a檢測試劑盒（熒光 RTPCR 法）陽性判斷值的建立。產品預期用途為體外定性檢測人糞便樣本中的 miR-92a核酸，臨床上用于對大腸癌的輔助診斷。該產品采用受試者工作曲線（ROC曲線）進行陽性判斷值的建立。基于該產品預期用途，陽性判斷值建立過程需同時納入經臨床診斷確診為大腸癌的病例及經臨床診斷明確為非大腸癌的病例。研究過程共納入大腸癌病例226例，病例涵蓋了大腸癌不同的分型、分期；同時，為了更充分研究產品的陽性判斷值，納入了健康人及其他非大腸癌病例，其中健康人199例、息肉患者36例、肝癌患者30例、腸炎患者30例、食道癌患者30例、胃癌患者30例、腺瘤患者30例、胃炎患者30例、闌尾炎患者30例、結腸炎患者30例、消化性潰瘍患者30例、胰腺癌患者30例、膽管癌患者30例、口腔癌患者30例，非大腸癌病例總計595例。采用 miR-92a檢測試劑盒（熒光 RT-PCR 法）對其進行檢測，檢測結果采用SPSS 15.0統計分析軟件進行 ROC 曲線分析，根據約登指數的分析結果，取約登指數最大所對應的CT值30.75為陽性判斷值（cut off value）。本研究從病例的確認方法、病例數量、病例的多樣化等方面均滿足產品陽性判斷值的建立過程。

3.2 參考區間的建立

參考區間的建立同樣應在產品完成前期研發且產品定型以后。參考區間與陽性判斷值不同，其為某一標志物在正常（健康）人群中的測量值范圍。參考區間的建立一般需經過如下過程[7]：參考個體的選擇、參考人群的確定、參考樣本組的確定、檢測樣本量值、統計量值分布、計算參考限值、得出參考區間。參考區間建立過程中，每一步驟的研究質量均會影響參考區間的科學性。

參考區間可能與健康或與其他生理或病理狀況有關，因此，確認參考個體的健康狀態非常關鍵。健康狀態的確認可采取排除法，每一項研究均有不同的健康排除標準，如：飲酒、疾病（最近）、獻血、哺乳期、血壓（異常）、肥胖、藥物濫用、職業、處方藥、口服避孕藥、自服藥、懷孕、環境因素、手術（最近）、空腹或不空腹、吸煙、遺傳因素、輸血（最近）、住院（最近或正在）、維生素濫用等。一個準參考個體的健康狀態需經過一系列檢查才能確定，這些檢查包括病歷檢查或現狀態生理指標的臨床實驗檢查。用于參考值研究的標準應具有詳細的描述和證明，實驗操作者根據此標準來判定參考樣品組的健康狀態。

參考群體在選擇的過程中還應關注年齡、性別、種族、生理病理狀態等因素，參考群體的這些特征應與產品預期使用人群的特征類似。許多情況下，與年齡相關的實驗室指標改變可能不代表健康狀況的變化，如老年人的總膽固醇或生長激素水平改變，因此年齡相關的參考區間更適用于臨床診斷，針對不同年齡段參考區間存在差異的產品，應根據產品臨床用途對不同年齡段的參考區間進行建立；對于某些標志物來說，男性與女性存在差異，如促卵泡生成素，男性與女性在參考區間上存在明顯差異，此類產品參考區間應針對男性和女性分別研究；針對某些檢測項目，參考區間容易受到種族等因素的影響，針對此類檢測項目，在參考區間的建立過程中應考慮產品適用的人群種族情況，特別是進口產品，如其境外上市的參考區間不適用于我國人群，應針對我國人群重新建立參考區間，而不能簡單地沿用境外上市的參考區間；有些參考區間容易受到目標人群生理狀態的影響，如抗繆勒管激素，其參考區間在女性絕經前與絕經后存在差異，此類產品其參考區間應針對不同生理狀態進行研究[8]。以上僅為幾種分類分層統計的舉例，研究者應根據產品具體情況設定參考人群。

參考區間研究過程中應充分合理地利用統計學，應采用合理的方法明確研究過程中是否存在異常值，如存在應將異常值剔除，如剔除異常值后樣本量不滿足統計學要求，應補充相應樣本。在統計分析過程中，研究者可根據檢測結果的分布（正態分布或偏態分布）情況，選擇合理的統計學方法建立參考區間。

針對臨床已經廣泛開展的檢測項目，其相關產品的參考區間也可引用相關臨床診療指南、診療共識，在參考區間引用過程中生產企業應充分考慮產品預期人群、檢測的原理（方法學）、檢測樣本類型等因素。以此方法建立參考區間的生產企業應對參考區間進行充分的驗證。

案例分析：癌胚抗原測定試劑盒參考區間的建立。產品預期用途為體外用定量測定人血清和血漿中癌胚抗原含量。主要用于對惡性腫瘤患者進行動態監測以輔助判斷疾病進程或治療效果，不能作為惡性腫瘤早期診斷或確診的依據，不用于普通人群的腫瘤篩查。基于產品預期用途采用非參數估計的方法建立產品參考區間。研究過程中入組722例經臨床診斷排除腫瘤的正常人。人群年齡范圍20～70歲，性別包含男性和女性，生活習慣涵蓋吸煙者和不吸煙者。將采集的樣本采用癌胚抗原檢測試劑進行檢測。統計分析根據人群差異分為四個亞組，使用非參數方法對各亞組的百分位數進行統計分析，各亞組的中位值和第95百分位數見表1。根據癌胚抗原生物學特性，各人群在臨床檢測過程中結果小于95%百分位數為陰性，反之為陽性，不同人群的參考區間建立完成。采用非參數法確定參考區間容易受不同人群的影響，因此，推薦各實驗室建立自己的參考區間。

表1 不同亞組人群統計分析結果Tab.1 Statistical analysis results of different subgroups

4 陽性判斷值或參考區間的驗證

為了保證產品陽性判斷值及參考區間建立的科學性，生產企業應在產品臨床前研究中對建立的陽性判斷值或參考區間進行驗證，陽性判斷值或參考區間的驗證所用人群應與建立過程的人群不同[9]。驗證試驗應選定合理的樣本例數，采用采集自產品預期適用人群的樣本進行研究。研究過程中注意判斷病例為陽性或陰性的方法應與產品陽性判斷值建立過程中所采用的方法一致。

產品臨床試驗是產品陽性判斷值及參考區間確認的重要證據。一般來說，產品的陽性判斷值應在臨床試驗前完成建立和驗證工作，在臨床試驗中應根據已經經過充分驗證的陽性判斷值進行檢測結果的判讀。如果臨床試驗中依據臨床參考標準認為陽性判斷值的設定存在偏差且需要調整，則調整后應重新入組臨床病例進行臨床試驗。

5 小結

陽性判斷值或參考區間在臨床檢驗診斷中具有重要的意義，臨床醫生必須依據科學合理的參考區間對體外診斷試劑產品的檢測結果進行判定和解讀，從而輔助針對患者的醫療決策，因此陽性判斷值或參考區間是產品不可或缺的屬性。

陽性判斷值和參考區間各有側重，醫療器械生產企業應根據產品預期用途，提供產品可靠的陽性判斷值或參考區間。陽性判斷值或參考區間的建立可通過參閱文獻或是企業自行制定。陽性判斷值的建立：生產企業應充分考慮產品臨床靈敏度與臨床特異性、陽性判斷值與預期用途的適應性，采用合理的方法（例如受試者工作曲線）建立陽性判斷值[10]。參考區間的建立：生產企業應謹慎進行參考個體的選擇、參考值測量的分析過程。參考群體的特征應與產品預期使用人群的特征類似。如有必要，生產企業應對制定的陽性判斷值或參考區間進行驗證。

綜上所述，生產企業應設定合理的研究方案，以期能夠采用科學合理的方式確定陽性判斷值或參考區間。