雞尾酒雙染CD31/D2-40和CKpan在脈管癌栓病理診斷中的應用價值

王玥元，趙 潔，田 芳，周慶云，石清芳

脈管癌栓與腫瘤患者的術后輔助治療及預后關系密切。近年多采用免疫組化CD31/D2-40標記血管、淋巴管內皮細胞，然而僅使用單項的免疫組化標記，仍無法確定脈管內細胞團是否有癌細胞，免疫組化雞尾酒雙染法是一種可以在組織中同時標記兩類不同抗原的方法，可同時雙染脈管內皮細胞和其內癌細胞[1-2]。本實驗聯合檢測CD31/D2-40和上皮細胞標志物(CKpan)，分別行HE染色、免疫組化單染CD31/D2-40、雞尾酒雙染CD31/D2-40/CKpan，分析雞尾酒雙染法在脈管癌栓病理診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年6月～2019年9月甘肅省婦幼保健院接受手術且經病理篩查有可疑脈管癌栓(排除淋巴結有轉移者)的子宮頸癌48例、子宮內膜腺癌30例、乳腺癌40例，標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，挑選有疑似脈管癌栓的切片，同時行HE染色、免疫組化單染CD31/D2-40、雞尾酒雙染CD31/D2-40/CKpan。

1.2 試劑及儀器CD31、D2-40、CKpan(AE1/AE3)鼠抗人單克隆抗體均購自福州邁新公司，雞尾酒雙染試劑盒購自美國羅氏公司。使用Ventana Benchmark XT免疫組化染色平臺。

1.3 染色方法

1.3.1免疫組化單染 65 ℃烤片1.5 h，烤片后貼標簽上機開始脫蠟(EZ)，堿性修復液(CC1)99 ℃ 30 min修復后，滴加一抗CD31/D2-40，CD31于37 ℃孵育32 min，D2-40于37 ℃孵育40 min，加二抗試劑(ultraView universal DAB kit)進行反應，呈棕色(二抗HRP multimer和DAB+H2O2的孵育時間均為8 min)，加入蘇木精和Bluing返藍液襯染，程序結束取出切片，梯度乙醇脫水至二甲苯，中性樹膠封固。

1.3.2雞尾酒雙染 玻片完成烤片貼標簽上機后開始脫蠟(EZ)，堿性修復液(CC1)99 ℃ 30 min修復，滴加一抗CD31/D2-40，CD31于37 ℃孵育32 min，D2-40于37 ℃孵育40 min，加入二抗試劑(ultraView universal DAB kit)進行反應，呈棕色(二抗HRP multimer和DAB+H2O2的孵育時間均為8 min)，反應結束升溫至95 ℃變性4 min。一抗CKpan，37 ℃孵育16 min/20 min，孵育結束加入抗試劑(ultraView universal AP RED kit)進行反應，呈紅色(二抗Red multimer反應12 min，Fast A+Naphtol和Fast B分別反應8 min)，加入蘇木精和Bluing返藍液襯染，程序結束取出切片，梯度乙醇脫水至二甲苯，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察染色。

1.4 結果判定D2-40定位于淋巴管內皮細胞的胞質中，CD31定位于血管內皮細胞膜，棕黃色為陽性；CKpan定位于上皮細胞質，紅色為陽性。

1.5 統計學分析所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化單染CD31/D2-40的表達臨床病理診斷中常有無法直接確認是否為脈管癌栓的情況，如組織處理過程中腫瘤細胞巢周圍形成的空隙(圖1)。本組切片經免疫組化單染CD31/D2-40，結果顯示：癌組織中血管與淋巴管內皮細胞著色，分別被染成棕色均勻平滑連續的細管狀，但仍然不能確定脈管內細胞團是癌細胞、淋巴細胞、紅細胞或組織細胞(圖2、3)。

2.2 雞尾酒雙染CD31、D2-40、CKpan的表達本組雞尾酒雙染切片中淋巴管、血管染成連續平滑著色的棕色細管狀，管內癌細胞的胞膜、胞質均勻著紅色，呈棕色細管包繞紅色細胞團(圖4、5)。

2.3 三種染色方法癌栓診斷陽性率比較所有切片染色后分別由兩位病理主任醫師采用雙盲法閱片。本組結果顯示：三種染色方法在子宮頸癌為87.50%、89.60%、83.30%；在子宮內膜癌為86.70%、80.00%、76.70%；在乳腺癌脈管癌栓為82.50%、87.50%、65.00%；總陽性率為85.60%、86.40%、75.40%。其中雞尾酒雙染法癌栓檢出率及總癌栓檢出率均低于其它兩種方法(表1)。HE染色與免疫組化單染在脈管癌栓檢出率為88.98%、86.44%，兩者差異無統計學意義(P=0.552，表2)。雞尾酒雙染法癌栓檢出率(75.42%)與HE染色(88.98%)、免疫組化單染(86.44%)相比，結果較低，差異有統計學意義(P=0.006，P=0.031，表3)。

表1 三種染色方法診斷脈管癌栓的陽性率

表2 HE染色與免疫組化單染脈管癌栓檢出率比較

表3 雞尾酒雙染與HE染色、免疫組化單染脈管癌栓檢出率比較

3 討論

癌細胞侵入腫瘤附近組織的血管和淋巴管形成靜脈癌栓和淋巴管癌栓，常規病理切片難以鑒別，臨床將淋巴管癌栓和靜脈癌栓統稱為脈管癌栓，脈管癌栓在腫瘤的預后分析中一直被視為重要危險因素，研究表明在子宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌等腫瘤中，脈管癌栓是復發(局部復發和遠處復發)和生存的獨立預后因素[3-7]。因此，準確有效的診斷脈管癌栓是病理診斷的重要組成部分。傳統HE染色對組織處理過程中癌細胞周圍產生的間隙與真正的癌栓無法準確鑒別，存在過診斷或漏診可能，多數情況下不能區分靜脈癌栓和淋巴管癌栓，目前這兩種癌栓的臨床意義尚不明確。本組使用CD31/D2-40行免疫組化單染和CD31/D2-40/CKpan雞尾酒雙染與HE染色對比，發現免疫組化單染雖然可以區分血管和淋巴管，但對于脈管內的細胞究竟是否為癌細胞沒有幫助，癌栓總檢出率比HE染色略高，差異無統計學意義，而雞尾酒雙染的癌栓檢出率最低，分別與HE染色、單染比較，差異有統計學意義。本組分析得出結論：(1)HE染色、免疫組化單染時有一部分不是癌栓的細胞團被誤診為癌栓，導致診斷癌栓陽性率偏高，即過診斷，增加了腫瘤患者術后輔助治療產生的經濟負擔和心理負擔。(2)與其它兩種方法相比，雞尾酒雙染實驗結果直觀，可高效發現癌栓，提高病理診斷的準確性，值得在臨床病理工作中推廣應用。本實驗只關注于上皮組織來源腫瘤的癌栓，如肉瘤則不適用于雞尾酒雙染CD31/D2-40/CKpan。另外，即使在雞尾酒雙染切片中診斷癌栓同樣需結合癌細胞的形態學特征及其他免疫組化表達，進行綜合判斷。