重組人謬勒管抑制素/抗謬勒管激素國際參考試劑協作研究

于 婷,孫 楠,孫 晶,楊 振,黃 杰

中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所，北京 100050

謬勒管抑制素也稱抗謬勒管激素(AMH)，因其可引起雄性胎兒的苗勒管退化而得名，是一種由男性睪丸支持細胞和女性卵泡顆粒細胞分泌的二聚體糖蛋白，在胚胎的性別分化中參與早期性器官定向分化[1-2]。AMH可抑制女性卵泡細胞的生長，調節男性睪丸間質細胞的功能。血清中AMH水平可用于評估卵巢儲備功能，輔助診治相關疾病如卵巢功能早衰、性別發育異常等[3-5]，臨床上主要用于輔助生殖技術等[6-8]。

世界衛生組織(WHO)生物標準化專家委員會在2015年已認識到有必要制定AMH的國際標準(IS)，用于校準人血清和血漿中AMH免疫分析測定。因此，英國生物制品檢定所(NIBSC)采用捐贈的人重組AMH，制備了編號為16/190的AMH國際標準品候選品。并在2018年開展了協作標定，目標是：(1)用各自方法校準的不同免疫分析方法測定16/190中AMH水平；(2)評價16/190用于AMH免疫分析校準的適用性；(3)評價16/190經熱加速降解后的穩定性。中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室代表中國實驗室應邀參加了本次國際協作標定研究，全球共有4個國家7個實驗室參加，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 AMH國際候選品：編號分別為16/190、A、C、D～H，為編號不同的同一標本，0.5 mL溶液凍干后殘余物，內容物包括1.2 mg牛酪蛋白，2.5 mg海藻糖和理論上500 ng重組人AMH。編號為16/190的安瓿標本，為預實驗用標本，目的是先確認各試劑對其的反應性，以便在正式實驗前可以找到合適的線性范圍。編號A和C的安瓿標本，為正常保存狀態標本，互為復管，平行測定用。D～H為熱加速標本，分別保存于4、45、37、20和-20 ℃條件下21個月13天。

AMH國際候選品的比較標本：編號為B，內容物約為候選品的50%。

17份人血清標本(編號為AMHSerum1～AMHSerum17)：每份0.6～0.8 mL，經酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法確定AMH水平在0.9～17.0 ng/mL范圍內。5份編號為AMHPlasma18～AMHPlasma22人血漿標本，每份標本為0.6～0.8 mL，經ELISA確定AMH水平在<0.1～12.0 ng/mL范圍內。4份標本濃度超過10 ng/mL。這些標本編號分別為：5、9、16和22。因此，線性范圍≤10 ng/mL的試劑盒在檢測前應采用標本稀釋液進行1∶1稀釋。血清/血漿樣品來自英國First Link公司、英國TCS生物科學公司或法國CERBA標本公司。一些標本為絕經后人血清稀釋得到。來自英國First Link公司和美國TCS生物科學公司的血樣已檢測HIV 1和2、HIV p24、HBsAg、抗-HCV和梅毒螺旋體抗體，結果均為陰性。來自法國CERBA標本公司的標本為臨床剩余標本，經NIBSC檢測，HBsAg、HIV抗體和HCV RNA均為陰性。

NIBSC根據各實驗室的分析能力和可提供的標本數量分配標本。本實驗室得到的標本為：16/190(A、B、C)、17份血清標本和5份血漿標本。

1.2儀器與試劑 本次國際協作標定用的試劑盒，包括10種化學發光法(含電化學發光、磁微粒化學發光等)、兩種酶聯免疫法(含酶聯免疫熒光法)和1種免疫熒光層析法試劑盒，共計13種，分別是：抗繆勒氏管激素測定試劑盒(化學發光法)、抗繆勒氏管激素測定試劑盒(免疫熒光層析法)和抗繆勒氏管激素測定試劑盒(酶聯免疫法)，以上3種均由深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司提供；AMH檢測試劑盒(磁微粒化學發光法)，泰州澤成生物技術有限公司；AMH測定試劑盒(化學發光免疫分析法)，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；AMH測定試劑盒(酶聯免疫熒光法)，梅里埃診斷產品(上海)有限公司；AMH檢測試劑盒(電化學發光法)，羅氏診斷產品(上海)有限公司；AMH測定試劑盒(化學發光法)，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；AMH檢測試劑盒(磁微粒化學發光法)，鄭州安圖生物工程股份有限公司；AMH測定試劑盒(化學發光免疫分析法)，廣州市達瑞生物技術股份有限公司；AMH測定試劑盒(化學發光免疫分析法)，深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司；AMH測定試劑盒(化學發光免疫分析法)，上海透景生命科技股份有限公司；AMH測定試劑盒(磁微粒化學發光法)，北京利德曼生化股份有限公司。

1.3WHO研究方案 實驗設計：(1)收樣后，應放置于-20 ℃或以下保存；(2)AMH候選品各編號標本及B標本，使用前均應平衡至室溫，以減少水分吸收；血清標本使用前應恢復至室溫，等其內容物徹底融化，并應充分輕柔混勻；血漿標本使用前應在37 ℃水浴中放置6 min融化，1 500 r/min(250×g)離心10 min，取上清備用；(3)AMH候選品各編號標本及B標本均采用1.0 mL去離子水充分溶解得到儲備液，進一步的配制應選擇適當的緩沖液進行。緩沖液應含有一定量的蛋白以防止表面吸附，通常為0.1%(w/v)牛血清清蛋白或0.1%(w/v)人血清清蛋白。如果在后續的分析中不能使用新鮮開封的AMH國際標準品或候選品，建議將儲備液分裝，并置于-20 ℃及以下保存；(4)為更好地比較不同免疫學分析方法，需要所有參加實驗室在各自試劑盒的線性范圍內，且配制AMH候選品各編號標本及B標本的濃度應盡量保持一致(16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250和0.125 ng/mL)，如線性范圍不能滿足要求，則應至少包含上述中的5種濃度，每種濃度標本至少3次重復(采用96孔板檢測的試劑可僅重復兩次)；(5)每種方法至少進行兩次獨立分析，每次分析均應包含分配的所有樣品、稀釋液及試劑盒校準品。

1.4方法 本次國際協作標定嚴格按照WHO的要求進行。按照各試劑盒說明書進行檢測分析。

預實驗：僅分析16/190，先確認各試劑對其的反應性，以便在正式實驗前找到合適的線性范圍。正式實驗中檢測A、B、C、17份血清標本和5份血漿標本。

標本復溶與系列溶液配制：16/190、A、B和C均采用1 mL去離子水充分溶解，16/190、A和C均得到500 ng/mL的儲備液，B得到約250 ng/mL的儲備液。進一步稀釋采用各試劑盒專用稀釋液，在各試劑盒的線性范圍內，按照要求進行配制。血清和血漿按照WHO方案進行處理。

劑量-反應曲線的建立：預實驗中，僅包括16/190及試劑盒校準品2條劑量-反應曲線；正式實驗中，包括A、B、C及試劑盒校準品各1條劑量-反應曲線。每條曲線含7～8種濃度，每種濃度及稀釋液重復測定2～3次。

1.5統計學處理 以參加實驗室上報的AMH濃度進行分析。為確定是否具有可接受的稀釋線性，每個獨立實驗中，如果log10(測定濃度)與log10(理論濃度)的擬合回歸線性的斜率在0.91～1.10內，且r2>0.975，實驗有效。此外，只有當2個重復標本(A、C)測定值的比值在0.91～1.10范圍內，獨立實驗結果有效。對所有有效結果采用稀釋因子校正后，得到各實驗室的未加權幾何均值(GM)，合并這些結果計算整體未加權GM。實驗室間變異采用GM均數變異系數(GCV)表示[GCV=(10s-1)×100%，s是log10轉換值的標準差]。由于可能出現離群值和異常結果，同時采用了R的package“WRS2”計算穩健均值。

2 結 果

2.1候選品結果 按照WHO方案中的數據處理原則，以各試劑盒校準品曲線計算得到的16/190濃度，結果見表1。本實驗室提交的13套數據中，按照WHO的數據處理原則，方法1、4、10和11不滿足擬合回歸線性斜率在0.90～1.11內，方法3不滿足A與C的比值在0.91～1.10內，最終有效數據8套。將無效數據剔除后進行匯總分析，A和C結果合并后得到，濃度GM為448 ng·安瓿-1(95%CI:377～531 ng·安瓿-1，n=8，GCV=23%)，WHO的結果為511 ng·安瓿-1(95%CI:426～612 ng·安瓿-1，n=16，GCV=42%)，本實驗室測定值與WHO測定值的相對偏差為-12%。B的結果為濃度幾何均值為246 ng·安瓿-1(95%CI:196～310 ng·安瓿-1，n=8，GCV=32%)，WHO結果為269 ng·安瓿-1(95%CI:221～328 ng·安瓿-1，n=16，GCV=45%)，本實驗室測定值與WHO測定值的相對偏差為-7.8%。B的預期濃度約為A或C的一半，本實驗室得到的比值為0.55(95%CI:0.50～0.61，n=8，GCV=13%)，實際結果與預期結果基本一致，表明在一種方法中，對AMH的識別是一致的。WHO結果為0.53(95%CI:0.50～0.56，n=16，GCV=12%)，本實驗室測定值與WHO測定值的相對偏差為3.8%。

表1 安瓿A、B、C中AMH濃度、A和C的GM及B/(A和C的GM)

2.2血清及血漿標本結果 NIBSC共提供17份血清標本及5份血漿標本，本實驗室結果見表2。本實驗室共提交13套數據，每套數據中兩組平行測定結果。其中1套數據與其他結果差異較大，經統計分析后剔除。

從結果可以看出，除低值標本(AMHPlasma18)外，其他21份血清或血漿標本，各家測值差異整體來說比候選品的差異稍小，但均超過10.0%，CV在12.3%～28.9%內，GCV均值為17.4%(95%CI:15.7%～19.2%)。因18號血漿標本濃度接近零值，22號標本濃度超出多家檢測試劑盒線性范圍，WHO總結數據中，剔除這兩個標本的結果。本實驗室測定值與WHO測定值的相對偏差在-7.3%～11.5%內。

表2 AMH血清及血漿標本的GM及與WHO測定結果的比較

最終，4個國家7個實驗室共同完成了本次協作標定。本實驗室提供了13套檢測數據，占總提交數據(21套)的61.9%，其中8套數據被WHO采納，占全部有效數據(16套)的50.0%。經WHO統計匯總分析，16/190的濃度GM為511 ng·安瓿-1(95%CI:426～612 ng·安瓿-1，n=16，GCV=42%)，穩健均值為489 ng·安瓿-1，且穩定性均滿足要求。但因16/190與患者標本在多個方法中不具互換性，經NIBSC提議，WHO生物標準專家委員會審核批準，16/190為AMH第1次國際參考試劑，濃度為489 ng·安瓿-1。

3 討 論

AMH分子由兩個通過二硫鍵連接的相同糖基化亞基組成，每個亞基都可裂解形成N-端和C-端二硫鍵合的二聚體，二聚體保持非共價結合。有報道稱，可以從血清中分離出裂解和未裂解的AMH[9]。目前臨床上使用的免疫分析中，所使用的抗體識別的多是總AMH。

候選品原料來自美國馬薩諸塞州總醫院兒科外科研究實驗室捐贈給NIBSC的重組AMH，從穩定CHO細胞株LR-MIS的培養基中純化得到。該重組AMH表達來自人血清清蛋白(HSA)具有前導序列的人AMH序列，在氨基酸423-428的內部裂解位點有修飾，從RAQR/S轉變成RARR/S[10]，HSA前導序列在成熟過程中被裂解。NIBSC在2016年以該原料制備了編號為16/190的AMH國際候選標準品。目前的AMH免疫分析結果以質量單位(ng/mL)或摩爾單位(pmol)為單位，使用轉換因子1 ng/mL=7.14 pmol/L，這是基于聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的糖基化二聚體的表觀分子量[11-12]。但AMH質量單位的可追溯性并不清楚，所以尚未建立AMH參考方法。

本次AMH國際協作標定共有4個國家7個實驗室參加，采用了21種方法。本實驗室采用了13種方法，10家國產試劑和3家進口試劑，基本涵蓋在我國開展AMH檢測的所有原理的試劑盒，其中以化學發光法檢測試劑盒為主，這是目前的主流方法，也是國際上的主流方法，以上結果表明本研究數據具有非常好的代表性，本實驗室的結果為WHO評價16/190作為第1次AMH國際參考試劑提供了豐富、可靠的數據。

由于目前AMH檢測無參考方法，亦無上一代國際標準品，所以NIBSC采用了各AMH試劑盒直接測定值進行聯合定值，以全部結果的穩健均值作為最終結果。在剔除不滿足要求的數據后，本實驗室得到的結果為：448 ng·安瓿-1(95%CI：377～531，n=8，GCV=23%)，16/190實測值的最低值僅為283 ng·安瓿-1，最高值達到556 ng·安瓿-1，最低值與最高值之間相對偏差達到49%。而在WHO報告中，全部實驗室AMH國際候選標準品的免疫效價匯總結果在282～1 157 ng·安瓿-1內，GCV達到42%。這些結果表明了目前各AMH檢測試劑盒之間測定結果的一致化程度并不是很好。其原因可能因為重組AMH和天然AMH在分子構成、構型等方面存在差異，而且各家包被的抗體來源不一定相同，識別AMH抗原位點不一致，均可導致抗原抗體間反應性不一致；另一方面，緩沖體系與真實標本血清基質存在差異，即基質效應也可造成測值結果不一致等；此外，還與各測定原理和技術的不同、數據處理的曲線擬合方式差異有關等。

除定值結果不理想外，WHO提供的互換性實驗結果顯示，僅6種方法中的16/190和標本具有互換性，3種方法具有部分互換性，7種方法無互換性。以上結果表明，如果將16/190定為國際標準品，既無溯源依據支持，亦無實際數據支持，實際應用中必然存在一定爭議。鑒于上述因素，NIBSC不建議將16/190作為人重組AMH的國際標準品，但是為了進一步促進AMH校準和免疫學分析，他們向WHO推薦16/190作為參考試劑，并且在說明書中明確說明賦值采用的是當前的免疫分析法，筆者亦認為這種做法是合理的。在未來可嘗試以人血清為基質建立AMH參考盤，或者采用提取的人源性AMH制備國際標準品，以協調AMH免疫分析方法之間的差異，促進AMH免疫分析的標準化。