血清層粘連蛋白熒光免疫層析檢測方法的建立及性能評價*

劉朝陽，趙 方，欒大偉，李雅慧，劉 萍，盧晉英

1.博奧賽斯(天津)生物科技有限公司，天津 300300;2.天津市化學發光與快速診斷分析技術企業重點實驗室，天津 300300;3.天津市第三中心醫院，天津 300000

近年來，肝纖維化日益受到人們的重視，已成為肝病研究領域的熱點。諸多病因如病毒、乙醇、藥物等所致的肝細胞炎癥、壞死均可引起肝纖維化。肝纖維化為慢性肝病發展至肝硬化過程中的病理組織學變化，是發展到肝硬化的必經階段[1]。其疾病過程為：慢性肝病-肝纖維化-肝硬化-肝癌。研究認為肝纖維化尚有逆轉至正常肝的可能，而肝硬化則不能[2-3]。所以，肝纖維化在一定條件下可被逆轉，早期發現、阻斷肝纖維化對治療慢性肝病十分重要[4]。

層粘連蛋白(LN)是細胞間外間質(ECM)中的非膠原糖蛋白，大量沉積于基質膜的透明層[5-6]。在肝纖維化發生過程中，患者細胞外基質的代謝產物可釋放到人體血液之中，LN即為該種代謝產物，研究發現其可作為非酒精性脂肪肝、肝癌等肝臟疾病中肝纖維化的血清學標志物[7-11]。本研究旨在建立一種LN熒光免疫檢測方法，用于定量檢測人血清LN水平，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取天津市三中心醫院肝纖維化和肝硬化患者的血清標本，溶血、黃疸、脂血等標本剔除。標本血清為空腹靜脈采血，分離出血清立即用于分析，可于4 ℃冰箱中保存，長期存放應保存在-20 ℃以下，并避免反復凍融。

1.2儀器與試劑 噴金劃線儀HM3030、寬型切條機CM3020、微電腦斬切機，熒光免疫分析儀P200為博奧賽斯(天津)生物科技有限公司研制生產。LN化學發光檢測試劑由博奧賽斯(天津)生物科技有限公司提供。熒光微球購自Thermo公司，鏈霉親和素購自Sigma公司，硝酸纖維素膜(NC膜)購自PALL公司，其他試劑均為國產分析純。LN抗原、抗體均購于梅迪賽斯生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1LN固相抗體制備 分別將LN抗體及鏈霉親和素配置成一定濃度的溶液，使用噴金劃線儀分別包被在NC膜的檢測區和質控區，37 ℃干燥后密封室溫保存備用。

包被濃度的選擇試驗方法：分別選用以下3種緩沖液稀釋LN抗體及鏈霉親和素進行包被，測定其包被效果。緩沖液1#：pH8.0，緩沖液2#：pH6.4，緩沖液3#：pH7.2。

1.3.2熒光標記抗體制備 取0.10 mL熒光微球，清洗1次(0.10 mol/L硼酸鹽緩沖液)加入0.12 mg/mL的活化劑可溶于水的碳二亞胺(EDC)，混勻，加入LN抗體至100.00 μg/mL。交聯4 h，加牛血清清蛋白(BSA)至20.00 μg/mL，封閉過夜，4 ℃保存備用。

熒光標記抗體稀釋比例選擇試驗方法：LN抗體微球分別以1∶30、1∶50、1∶100比例稀釋，測定其效果。

1.3.3層析時間的選擇 比較層析12、15、18 min不同時間下對試驗結果的影響。

1.3.4試劑盒的組裝 將吸水紙、NC膜、樣品墊按順序粘貼組成試劑板，用斬切機將試劑板分切成(4.0±0.2)mm的試劑條。將試劑條裝入卡中扣合，即為完整檢測卡。

1.3.5檢測緩沖液配置 LN熒光標記抗體終濃度以1/100，質控熒光標記抗體濃度以1/500，其他以稀釋液補充，配置檢測緩沖液。

1.4熒光免疫層析分析

1.4.2精密度 抽取3個批次的LN檢測卡，選取高值和低值標本分別重復測試各10次，進行精密度檢測。計算批內變異系數(CV)與批間CV，可得出檢測卡的精密度數據。

1.4.3線性試驗 將接近線性范圍上限的高值標本按一定比例稀釋為5種濃度，其低值濃度的標本需接近線性范圍下限，使用LN測定試劑盒(熒光免疫層析法)測定，每一種濃度重復測定3次，計算其平均值，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數(r)。r≥0.990 0判定為符合標準。

1.4.4準確度 準確度以回收試驗來評估。取LN的臨床檢測高值標本，與低值標本以1.0∶9.0的體積比例混合，測試高值標本、低值標本與混合標本的實際濃度值，各平行測定3次取均值。

回收率=(混合標本測值×10-低值標本測值×9)/高值標本測值

1.4.5鉤狀效應(Hook效應) 用滅活的小牛血清作稀釋液，將LN高值校準品配置成一系列濃度，平行測定每種濃度校準品兩次熒光強度值，取其均值。

1.4.6對比試驗 與市售LN檢測試劑盒(化學發光法)平行檢測100份臨床血清標本，記錄結果，計算相關性。市售LN檢測試劑盒按照其說明書進行檢測操作。

1.5統計學處理 采用2010版本Excel進行趨勢分析，采用SPSS20.0對檢測結果進行統計分析。

2 結 果

2.1方法學建立

2.1.1包被濃度的選擇 隨標本濃度值的升高，測試所得T/C值隨之升高，緩沖液1#測試結果與標本相關性較好，選擇緩沖液1#。見圖1。

圖1 包被濃度的選擇

2.1.2熒光標記抗體稀釋比例的選擇 LN抗體微球稀釋實驗結果顯示，1∶50比例稀釋的檢測緩沖液，隨標本濃度值的升高，測試所得T/C值隨之升高，1∶30比例稀釋的檢測緩沖液測試T/C值偏高，表明LN抗體微球濃度偏高。綜合考慮，以1∶50為基礎稀釋比例。見圖2。

圖2 熒光標記抗體稀釋比例的選擇

2.1.3層析時間的選擇 層析時間試驗結果顯示，20 ng/mL標本在7.5 min后測值已經穩定，100 ng/mL標本在10 min后測值趨于穩定，800 ng/mL標本在12.5 min后較穩定。CV結果顯示，層析12 min標本CV>10.00%，15、18 minCV均<10.00%；綜合以上，同時考慮時間效率因素，選擇層析時間為15 min。見圖3、表1。

圖3 層析時間的選擇

表1 不同層析時間的標本CV(%)

2.2方法學驗證

2.2.1靈敏度 LN檢測卡的空白限分別為3.35、3.27、4.22 ng/mL，符合行業標準。見表2。

表2 空白限試驗結果

2.2.2精密度 經過3個批次的CV測試，可得出3批LN檢測卡的低值批內精密度分別為6.12%、3.18%、6.08%，高值標本批內精密度分別為6.51%、4.74%、5.21%，選取最大值6.51%為本檢測試劑盒的批內精密度；高低值標本的批間精密度分別為5.87%、6.23%，選取最大值6.23%為本檢測試劑盒的批間精密度。見表3。

表3 檢測卡精密度分析

2.2.3線性 在20～800 ng/mL的線性范圍內，LN檢測卡的線性r為0.998 9。見表4、圖4。

表4 線性試驗結果(ng/mL)

2.2.4準確度 經過3批LN檢測卡的回收率測試可知，回收率為86.03%～97.50%，產品重復性較好。見表5。

圖4 擬合方程圖

表5 檢測卡回收率分析

2.2.5Hook效應分析 LN濃度從800 ng/mL升至8 000 ng/mL時，檢測的熒光強度值隨濃度增加而升高，沒有出現Hook效應。見表6。

表6 Hook效應分析

2.2.6方法學比較 與化學發光LN試劑盒比對，檢測100份臨床標本，兩種方法學的檢測結果回歸方程為Y=1.021 9X-1.172 0，r=0.987 1。見圖5。

圖5 兩種試劑盒測定血清標本LN水平的相關性圖

3 討 論

LN屬于細胞外基質成分，隨著肝纖維化病情發展越來越嚴重，細胞外基質成分在血清的濃度會明顯上升，因此對判斷肝病和肝纖維化的嚴重程度具有重要價值。

本研究開發的LN測定試劑盒為熒光免疫分析測定系統，采用熒光示蹤物標記抗原或抗體，與待測物進行一系列免疫反應，通過測定反應產物的熒光強度以分析待測物濃度。本研究結果顯示熒光免疫分辨檢測LN方法的回收率為86.03%～97.50%，空白限為4.22 ng/mL，線性范圍為20～800 ng/mL，r=0.996 5；批內精密度為6.51%，批間精密度為6.23%。與市售LN試劑平行檢測100份血清標本，有良好的相關性(Y=1.021 9X-1.172 0，r=0.987 1)。這表明本試劑盒測試重現性好，與市售試劑盒有良好的相關性。

時間分辨免疫測定熒光是目前應用非常廣泛的微量分析技術之一[12-16]，具有專一性強、靈敏度高、實用性好、檢測時間短、價格低廉等優點。時間分辨免疫層析以銪熒光微球為標記物，與傳統熒光標記物相比，其有獨特的熒光特性：熒光壽命長、stokes位移大、激發光譜和發射光譜無交叉、特征峰尖銳、標記物體積小、靈敏度高、可定量。該方法最快15 min出結果，可用于快速對大量患者的血清學標本進行檢測。高通量的免疫學篩查無實驗室限制，便于在二級及其以上醫院快速推廣。同時，基于LN檢測試劑制備低成本的快檢試劑，可以用于社區等基層醫療機構對就醫人群進行快速、低成本的篩查，以便實現集中患者、集中資源、集中專家、集中收治，以及實現醫療資源的高效運轉。

綜上所述，本研究建立的LN熒光免疫分析檢測方法符合臨床檢驗需求，在臨床檢驗中具備應用價值，值得推廣使用。