貴州地區(qū)57例遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白增高癥遺傳因素分析*

熊永紅，李 頔，胡 莉，姜敏敏，黃盛文△

1.貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,貴州貴陽 550000;2.四川省廣安市廣安區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,四川廣安 638000

由于各種遺傳因素導致血紅蛋白F(HbF)在成人期持續(xù)性表達增加，被稱為遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白增高癥(HPFH)[1]。HPFH一般無明顯臨床癥狀，血液學檢查相對正常，或者僅表現(xiàn)為輕微的小細胞低色素貧血，但當HPFH復合β珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)時，可導致輕、中間或者重型地貧[2]。HPFH根據(jù)基因缺陷的不同分為缺失型HPFH和非缺失型HPFH(nd-HPFH)兩大類，前者主要是β珠蛋白基因簇的大段缺失所致，該類型基因也是造成臨床較常見的中間型地貧的主要病理缺陷之一[3]；nd-HPFH主要是γ珠蛋白基因啟動子區(qū)域或其他修飾基因點突變或小片段的缺失，影響了反式作用因子與啟動子的結(jié)合，或珠蛋白基因表達調(diào)控異常而導致γ珠蛋白基因的持續(xù)表達。

人群中HbF水平具有數(shù)量遺傳的特性，除珠蛋白基因的遺傳缺陷導致HPFH外，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)了與HbF水平升高相關(guān)的多個基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，包括HBS1L-MYB基因間區(qū)域、BCL11A、ANTXR1、KLF1基因等[4-6]。本研究應用PCR擴增技術(shù)及Sanger測序技術(shù)，檢測HPFH中珠蛋白基因遺傳缺陷及與HbF水平相關(guān)的多個SNP位點的基因型，分析貴州地區(qū)HPFH相關(guān)的遺傳因素。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2019年4月于貴州省人民醫(yī)院行血紅蛋白電泳檢測的患者，納入標準為符合以下兩條標準之一：(1)年齡≥2歲，血紅蛋白A2(HbA2)<3.5%，HbF>5%；(2)年齡≥2歲，HbA2≥3.5%，HbF>10%。排除標準：影響HbF水平的疾病，如地貧、血液系統(tǒng)腫瘤、范可尼貧血等。共收集57份HPFH患者的標本，其中男18例，女39例；年齡3～62歲。另選取同期貴州省人民醫(yī)院體檢健康者血樣50份作為對照標本，血常規(guī)和血紅蛋白電泳檢測各指標均在正常范圍內(nèi)。對照組中男21例，女29例；年齡18～70歲。本研究臨床標本獲取已通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 核酸提取儀(NP968,西安天隆科技有限公司)；PCR儀(Veriti 96孔溫度梯度PCR儀，美國Applied Biosystem公司)；DNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)；寡核苷酸引物(生工生物工程上海股份有限公司)；2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司)；α/β地貧基因檢測試劑盒(深圳益生堂生物企業(yè)有限公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取及地貧基因檢測 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血2 mL，核酸提取儀磁珠法提取全血基因組DNA，完善地貧基因檢測，具體操作按α地貧基因檢測試劑盒(Gap-PCR法)說明書和β地貧基因檢測試劑盒(PCR探針法)說明書進行。

1.3.2缺失型HPFH基因檢測 從國際生物基因數(shù)據(jù)庫(NCBI數(shù)據(jù)庫)查找β珠蛋白基因序列，根據(jù)Gap-PCR跨越斷裂點的技術(shù)原理，運用Primer premier 5.0軟件分別在東南亞型HPFH(SEA-HPFH)及中國型Gγ+(Aγδβ)0-地貧缺失區(qū)域兩側(cè)翼及缺失區(qū)域內(nèi)，設計擴增缺失截短片段與正常內(nèi)對照片段的Gap-PCR引物。SEA-HPFH：缺失上游引物5′-ATTGTTGAGTTGCAGGATCG-3′,正常內(nèi)對照上游引物5′-TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3′，共同下游引物5′-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3′。中國型Gγ+(Aγδβ)0-地貧：缺失上游引物5′-AGAAATTGCCTCATGTCTCT-3′，正常內(nèi)對照上游引物5′-TGCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3′，共同下游引物5′-GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3′。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

PCR反應體系如下，PCR混合液：12.5 μL，引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加水補充至25.0 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性60 s，58/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶的大小和特異性。

1.3.3HbF水平相關(guān)SNP位點多態(tài)性檢測 從NCBI數(shù)據(jù)庫查找XmnI-HBG2(rs7482144)，ANTXR1(rs4527238)，BCL11A(rs4671393)，HBS1L-MYB(rs28384513、rs9399137)，KLF1(rs3817621、rs2072597、rs117351327)，HBG1-HBD(rs10128556)的基因序列，針對各SNP位點用Primer premier 5.0軟件設計引物，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物擴增序列見表1。PCR反應體系如下，PCR混合液：12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加水補充至25.0 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，按退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共45個循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5.0 μL進行瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶的大小和特異性，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司Sanger測序。測序結(jié)果與GeneBank中的參考序列進行比對，對各SNP位點進行基因分型。

1.4統(tǒng)計學處理 用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，并采用χ2檢驗判斷各SNP位點基因型和等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1缺失型HPFH檢測結(jié)果 57份標本中，檢出2份SEA-HPFH雜合突變復合β地貧(SEA-HPFH/CD17)。未檢出中國型Gγ+(Aγδβ)0-地貧。電泳結(jié)果見圖1。其中1例患者表現(xiàn)為輕度貧血[Hb:108 g/L,平均紅細胞體積(MCV):75 fL,平均紅細胞血紅蛋白量(MCH):22.7 pg]，另1例為中度貧血(Hb:88 g/L,MCV:64.2 fL,MCH:20 pg)。

2.2Sanger測序結(jié)果 檢出55份nd-HPFH標本和50份對照標本各SNP位點基因型及等位基因頻率分布見表2。根據(jù)Hardy-Weinberg平衡原理，對照組各SNP位點基因型頻率分布的觀察值和期望值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明入選人群各SNP位點的基因型和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

BCL11A基因rs4671393和KLF1基因rs3817621位點基因型與等位基因頻率分布在nd-HPFH標本與對照標本之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余SNP位點基因型分布在nd-HPFH標本和對照標本之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各SNP位點引物序列、擴增片段長度及退火溫度

表2 各SNP位點基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

續(xù)表2 各SNP位點基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

注:圖A、B為SEA-HPFH電泳圖，M為DL1000 DNA Marker；1～3、5～8、21～26、28為正常標本，4、27為陽性標本，565 bp為正常對照條帶，376 bp為缺失截斷片段。

3 討 論

HPFH是一種具有高度遺傳異質(zhì)性的血紅蛋白病，以成人期HbF持續(xù)性高水平為主要臨床特征，HPFH遺傳缺陷主要為β珠蛋白基因簇的大片段缺失及γ珠蛋白基因啟動子區(qū)點突變。近年來，研究發(fā)現(xiàn)其他染色體上多個修飾基因的SNP位點與HbF水平相關(guān)，這些數(shù)量性狀位點異常也可導致HPFH的發(fā)生[5，7-8]。

缺失型HPFH的分子機制主要涉及β珠蛋白基因簇上的δ、β及Aγ珠蛋白基因的缺失，在我國以中國型Gγ+(Aγδβ)0-地貧和SEA-HPFH最為常見[9-11]。本研究共檢測到2例缺失型HPFH，基因型均為SEA-HPFH復合β地貧CD17雜合突變。這2例患者HbF水平高達96.5%。有文獻報道，在SEA-HPFH復合β地貧CD41-42雜合突變時，其HbF水平同樣高達96.5%，但臨床僅表現(xiàn)為輕度貧血[12]。HPFH和β地貧的雙重雜合子與單純HPFH相比，具有較低的Hb水平及MCV、MCHC，本研究結(jié)果與文獻報道一致[13]。HPFH基因攜帶者與β地貧基因攜帶者婚配后，存在生育HPFH和β地貧復合雜合子的子女的風險，子女臨床可表現(xiàn)為重型或者中間型地貧。因此，診斷為β地貧的患者，如表型與基因型不符合，需要進一步檢測是否同時為中國型Gγ+(Aγδβ)0-地貧或SEA-HPFH等缺失型HPFH。

nd-HPFH主要形成機制是γ珠蛋白基因啟動子區(qū)的點突變或小片段缺失，影響轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與啟動子區(qū)的結(jié)合，從而增強γ珠蛋白基因的表達，使HbF水平升高[14]。本研究擴增Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)全長后直接測序，檢出Gγ-158(C→T)具有SNP，即XmnI-HBG2 (rs7482144)的突變頻率為20%。文獻報道不同人群中rs7482144的基因突變頻率為10%～30%[15]。TEPAKHAN等[16]的研究顯示XmnI-HBG2(rs7482144)的突變頻率為11.7%，低于本研究人群中該位點的突變頻率。Gγ-158(C→T)基因多態(tài)性與HbF水平相關(guān)，在攜帶Gγ-158位點T等位基因的重、中度地貧及鐮刀細胞貧血患者中HbF水平明顯升高[17-18]。目前，關(guān)于在HPFH患者中Gγ-158(C→T)多態(tài)性與高水平HbF的相關(guān)性研究鮮見報道。本研究中，Gγ-158(C→T)基因型在nd-HPFH標本和對照標本中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮該位點的基因型只有在某些特殊的病理狀態(tài)及紅細胞造血壓力下才能提高γ珠蛋白基因的表達[19-20]。Gγ-158位點的等位基因T并不一定都表現(xiàn)為高水平HbF，而高水平HbF也不一定都存在Gγ-158位點的T堿基的變異。因此，僅Gγ-158(C→T)突變尚不足以使HbF水平明顯升高，從而導致HPFH，推測可能該位點與其他基因中的SNP共同作用于γ珠蛋白基因，從而使HbF水平升高。

GWAS發(fā)現(xiàn)了與HbF水平升高相關(guān)的多個SNP位點，包括ANTXR1(rs4527238)，BCL11A(rs4671393)，HBS1L-MYB(rs28384513、rs9399137)，KLF1(rs3817621、rs2072597、rs117351327)和HBG1-HBD(rs10128556)。本研究中BCL11A基因rs4671393位點和KLF1基因rs3817621位點基因型在nd-HPFH標本和對照標本中的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示其在HPFH的發(fā)生中具有重要作用。BCL11A基因能夠編碼特異性造血轉(zhuǎn)錄因子，抑制γ珠蛋白表達，沉默BCL11A基因可增強γ珠蛋白基因表達。有關(guān)于BCL11A基因的實驗研究表明，BCL11A基因作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，對HbF水平起直接負調(diào)控的作用[21]。rs3817621位于KLF1基因啟動子區(qū)，KLF1是紅細胞生成發(fā)育過程中關(guān)鍵的細胞因子，對HbF水平的調(diào)節(jié)具有雙重作用：一方面KLF1基因編碼產(chǎn)物可直接與γ珠蛋白基因啟動子結(jié)合，直接激活γ珠蛋白鏈的表達；另一方面KLF1作為紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子可與BCL11A基因啟動子區(qū)結(jié)合，促進BCL11A基因表達，從而抑制γ珠蛋白基因表達[22]。ANTXR1(rs4527238)，HBS1L-MYB(rs28384513、rs9399137)，KLF1(rs2072597、rs117351327)和HBG1-HBD (rs10128556)位點基因型與等位基因頻率在nd-HPFH標本和對照標本中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，推測這些基因的單個SNP位點對HbF水平的影響較小，不排除在部分HPFH中HbF水平升高是多個SNP位點共同作用的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)貴州地區(qū)存在缺失型HPFH，并且BCL11A基因rs4671393和KLF1基因rs3817621位點多態(tài)性可能是導致nd-HPFH發(fā)生的遺傳因素之一。