慢性腎臟病患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平及臨床意義*

李超強(qiáng)，朱凱欣，黃美燕，徐軍發(fā)

中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.檢驗科，廣東東莞 523110；3.廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所，廣東東莞 523808

慢性腎臟病(CKD)是臨床常見病之一，2010年我國CKD患病率超過10.8%[1]。CKD病理表現(xiàn)為腎小球、腎小管炎性物質(zhì)浸潤及內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞不良增生，導(dǎo)致腎組織萎縮和纖維化。研究顯示，CKD患者血液中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和胎盤轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等細(xì)胞因子異常表達(dá)[2-3]。IL-37是一種新型細(xì)胞因子，在多種炎癥疾病患者血漿中檢出水平升高。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)CKD患者血漿IL-37水平升高，有效治療后血漿IL-37水平降低[4]。但I(xiàn)L-37在CKD中的作用機(jī)制不明確，本研究通過檢測CKD患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平，并分析血液相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步探討IL-37在CKD中的作用機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年9月至2018年12月中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院確診的36例CKD患者作為CKD組，其診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2014年慢性腎臟病指南[5]，患者入院前未接受過治療，未合并糖尿病、肝炎、肺結(jié)核、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及自身免疫性疾病。選取來自中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院健康體檢科的22例健康志愿者作為對照組。CKD組中，男20例，女16例；年齡(47.92±14.15)歲。對照組中，男12例，女10例；年齡(41.50±10.77)歲。兩組年齡、性別比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。將經(jīng)藥物或血液透析等治療大于10 d的18例CKD患者進(jìn)行治療前后的比較。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究通過中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，IL-37檢測試劑(美國BD公司)，尿酸(UREA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)試劑盒(德國羅氏公司)，胱抑素C(Cys-C)試劑盒(廣州科方生物技術(shù)股份有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)，邁瑞5180全自動血液分析儀(中國邁瑞公司)，COBAS C501全自動生化分析儀(德國羅氏公司)。

1.3血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平檢測 采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血3 mL，按照邁瑞5180全自動血液分析儀的操作方法進(jìn)行相應(yīng)血常規(guī)指標(biāo)和CRP水平檢測。

1.4腎功能指標(biāo)檢測 采集肝素抗凝血3 mL，分離出血清，按照COBAS C501全自動生化分析儀的操作方法進(jìn)行BUN、CREA、UREA和Cys-C水平檢測。

1.5外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平檢測

1.5.1外周血單核細(xì)胞分離 采集EDTA-K2抗凝血10 mL，300×g離心5 min，去血漿留血細(xì)胞沉淀。用等量無菌1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋血細(xì)胞沉淀并混勻，在15 mL離心管中，于人淋巴細(xì)胞分離液的液面上方沿管壁緩慢加入等量血細(xì)胞懸液，300×g離心20 min。用無菌吸管吸取白膜層加入含10%1640培養(yǎng)基1×PBS中，計數(shù)后，取1×106個細(xì)胞于兩管流式上樣管中，300×g離心5 min，棄上清液，染色后作流式細(xì)胞分析。

1.5.2單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平檢測 按IL-37流式細(xì)胞試劑盒的操作方法進(jìn)行，上機(jī)檢測后，根據(jù)單核細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中的前向散射(FSC)及側(cè)向散射(SSC)散點圖的特征，進(jìn)行單核細(xì)胞的設(shè)門，記錄標(biāo)本單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平。

2 結(jié) 果

2.1外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平及其他指標(biāo)情況 CKD組外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.147，P<0.05)。CKD組血液中性粒細(xì)胞數(shù)(NE#)，單核細(xì)胞數(shù)(MO#)，血清CRP，BUN，CREA、UREA和Cys-C水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組淋巴細(xì)胞數(shù)(LY#)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CKD組與對照組外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平及其他指標(biāo)的比較[M(P25，P75)]

2.2患者治療前后血液指標(biāo)情況 18例患者經(jīng)治療大于10 d，平均14.2 d，治療后組外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平低于治療前組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后組BUN、CREA、UREA和CRP水平均低于治療前組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后組血清Cys-C水平，血液MO#、NE#、LY#與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 治療前后外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平及其他指標(biāo)的比較[M(P25，P75)]

2.3患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平與其他血液指標(biāo)的相關(guān)性 患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平與血液中MO#(r=0.396 4,P<0.05)、NE#(r=0.343 5,P<0.05)及血清CRP水平(r=0.507 6,P<0.05)呈正相關(guān)，與LY#，血清BUN、CREA、UREA和Cys-C水平無相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

CKD是免疫炎性介質(zhì)參與的自身免疫性疾病，細(xì)胞因子生成和激活是疾病形成和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。研究顯示，IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、人胰島素生長因子1(IGF-1)、血漿內(nèi)皮素1(ET-1)和內(nèi)核因子-κB(NF-κB)等細(xì)胞因子異常分泌，可活化酪氨酸蛋白激酶(JAK)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號途徑，刺激腎組織內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，加重腎組織炎性反應(yīng)[6-7]。IL-8和IL-17還可直接誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤腎小球，加重腎組織局部炎癥和免疫損傷[8]。TGF-β可上調(diào)Smad7蛋白，激活NF-κB，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡；也可促進(jìn)Ⅰ型膠原合成，直接誘導(dǎo)腎臟組織纖維化[9]。ET-1、TGF-β和IGF-1可作用于腎組織，使腎系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)堆積，腎小球動脈硬化，引起水鈉潴留，造成水腫、高血壓等臨床癥狀[10-11]。因此，多細(xì)胞因子多途徑參與了CKD的發(fā)生與發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，CKD患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平明顯升高，經(jīng)藥物或血液透析治療后單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平下降，與CKD患者血漿IL-37水平的研究結(jié)果相似[4]。提示血漿IL-37與單核細(xì)胞內(nèi)IL-37有密切關(guān)系，血漿IL-37或來源于單核細(xì)胞[12]，且血漿和單核細(xì)胞中的IL-37均參與CKD的發(fā)生、發(fā)展。IL-37在CKD中的機(jī)制可能為：可通過抑制Toll樣受體激動劑，減少腎臟IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[13]；也可通過抑制NLRP3炎性小體的激活，影響炎性細(xì)胞的募集和Th1/Th2平衡[14]；與IL-18Rα鏈非競爭性地形成復(fù)合體，抑制NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等途徑，使得γ-干擾素(IFN-γ)的合成下調(diào)，抑制樹突狀細(xì)胞活性，從而延緩抗原提呈過程，抑制其免疫應(yīng)答[15]。此外，成熟的IL-37還可以進(jìn)入細(xì)胞核與Smad3蛋白結(jié)合，形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來抑制促炎因子的產(chǎn)生。總之，IL-37可通過抑制促炎因子表達(dá)、阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)抑炎因子表達(dá)等途徑抑制炎癥。因此，IL-37檢測是評估CKD治療效果的輔助性指標(biāo)。

血清中BUN、CREA、UREA和Cys-C聯(lián)合檢測能有效反映患者腎功能狀況，是患者藥物治療或血液透析后常規(guī)檢測的生化指標(biāo)。本文跟蹤檢測18例患者，結(jié)果顯示，患者經(jīng)藥物或血液透析后，外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37，血清BUN、CREA、UREA水平呈不同程度的降低，但血清Cys-C水平、血液MO#、LY#、NE#變化不明顯。這提示外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平降低與腎功能改善相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，CKD患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平與腎功能指標(biāo)中BUN、CREA、UREA、Cys-C無相關(guān)性，這提示外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平與CKD進(jìn)展不一定呈正相關(guān)，與之前研究結(jié)果相似[4]?？赡茉驗楦櫪龜?shù)少，沒有對CKD的分期進(jìn)行分析，但是隨著CKD向終末期進(jìn)展，機(jī)體并發(fā)癥增多，自身免疫應(yīng)答更紊亂，刺激IL-37表達(dá)的機(jī)制和途徑也更復(fù)雜。

外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞在炎性疾病中扮演著重要角色。炎性反應(yīng)會使外周血NE#、MO#和LY#不同程度地升高，參與抵抗病原侵入、吞噬異物、殺滅病菌等，并釋放大量趨化因子、IL-1、IL-6、TNF-α等。CRP是急性時相反應(yīng)蛋白，在機(jī)體發(fā)生炎癥或感染后，血漿CRP水平會升高，而且在急性、亞急性與慢性病理狀態(tài)下，CRP有不同特征性的改變[16]。CKD是一個慢性炎性過程，患者體內(nèi)炎性介質(zhì)的持續(xù)存在和炎性反應(yīng)刺激體內(nèi)NE#、MO#和LY#反應(yīng)性增多，參與腎組織的免疫防御，以阻止或延緩固有免疫及適應(yīng)性免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答[14]。在相關(guān)性分析中，CKD患者血液NE#、MO#及血清CRP水平與單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平呈正相關(guān)。提示IL-37與炎性細(xì)胞水平密切相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CKD患者血液中LY#略有升高，可能提示淋巴細(xì)胞更多轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，具有免疫性殺傷作用。抑炎因子IL-37、炎性細(xì)胞、炎性因子等不斷作用于腎臟組織，最終造成腎組織的免疫損傷及CKD形成。

綜上所述，CKD患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平升高，與血液MO#、NE#及血清CRP水平呈正相關(guān)。經(jīng)臨床藥物或血液透析有效治療后，CKD患者腎功能改善，外周血單核細(xì)胞內(nèi)IL-37水平下降。