免疫調節在骨組織愈合中的研究進展*

李 驍 綜述,唐正龍，田 艾 審校

(貴州醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，貴陽 550004)

創傷、感染、腫瘤、先天畸形等疾病會引起不同程度的骨損傷或缺損[1]，對于較大范圍的骨缺損主要采用骨移植修復。而自體骨移植因其突出的骨傳導性、骨誘導性、成骨特性和低免疫原性被認為是治療骨缺損的“金標準”。但自體骨移植存在著供骨部位二次創傷、術后并發癥、可獲取的骨組織有限和移植骨吸收過快等不足[2]。目前，隨著骨組織工程的深入研究，具有良好生物相容性的骨替代材料逐漸取代了以往的自體骨，進而減少或避免了自體骨移植術后風險及同種異體骨移植帶來的免疫原性和疾病傳播風險[3]。

免疫細胞在骨愈合過程中扮演重要作用。骨損傷后，首先進入骨微環境中的炎性細胞為免疫細胞，如中性粒細胞、巨噬細胞、T細胞、自然殺傷細胞(NK)、樹突狀細胞(DC)。在早期炎癥微環境中免疫細胞通過釋放多種細胞因子、趨化因子吸引各類細胞進入骨損傷區參與炎性反應，同時募集骨組織內骨髓間充質干細胞(BMSC)并調控其增殖、分化或凋亡。研究發現，成骨和破骨過程與免疫細胞間會通過兩者共有的調節通路[如核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)/核因子κ B受體活化因子(RANK)/骨保護素(OPG)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)/鞘氨醇1磷酸酯受體1(S1PR1)]相互影響，此現象被稱為骨免疫調節效應。骨免疫調節效應概論的提出，既強調了在骨形成過程中宿主對移植物的免疫反應，也強調了免疫細胞在骨修復過程中的關鍵調節作用，為骨愈合營造了一個有利的免疫微環境。本文就免疫細胞在骨愈合過程中的炎癥調節作用和骨微環境中相關骨形成細胞的生物學作用進行綜述，為臨床治療中構建具有局部免疫調節作用的骨替代材料提供新的設計思路和方法。

1 免疫細胞參與早期炎性反應

免疫調節在骨愈合過程中發揮關鍵作用，特別是在早期炎癥階段[4]。血腫形成和炎性反應是實現骨愈合的第一步[5]。骨髓內含有大量造血干細胞和BMSC，前者可分化為巨噬細胞、中性粒細胞和破骨細胞等，后者是成骨細胞的前體細胞，兩種干細胞共同參與骨愈合過程，使免疫系統和骨骼系統緊密聯系。近年來隨著對兩個系統間相互影響的深入研究，提出了新領域術語——骨免疫學，即骨損傷后，骨組織、骨內膜、骨膜表面、骨髓和周圍軟組織中血管破裂，血液外滲形成血腫；固有免疫系統中巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和NK細胞受血腫內血小板衍生因子、補體片段、壞死細胞和局部組織內巨噬細胞釋放的多種危險信號的刺激發生早期募集，聚集的免疫細胞釋放多種細胞因子調控BMSC、血管內皮細胞、成纖維細胞等組織修復細胞向損傷部位趨化及發生功能分化[5]。對骨愈合免疫調節作用機制的不斷探索，發現BMSC-成骨細胞系和單核-巨噬細胞-破骨細胞系間存在著復雜的調節網絡[6]。骨組織遭受外界不良刺激后，骨微環境中的單核細胞-巨噬細胞-破骨細胞通過胞外分泌細胞因子的形式相互作用、影響。靶向調節免疫細胞促進骨愈合和預防骨丟失成為骨組織工程研究的熱點。

2 中性粒細胞對骨愈合的調節

2.1 中性粒細胞調控早期炎性反應

中性粒細胞在組織損傷后12 h內進入血腫，以分泌細胞因子的形式募集免疫細胞啟動愈合級聯反應[7]。免疫細胞表達的模式識別受體與進入骨組織內的病原體相關分子模式和危險相關分子模式相互識別后結合啟動固有免疫反應，釋放促炎細胞因子產生早期急性炎癥。骨髓中的中性粒細胞進入外周血液循環后，在ELR+趨化因子(CXC)和趨化因子受體2(CXCR2)作用下經白細胞黏附級聯反應迅速遷移到炎癥或感染部位，通過吞噬活動清除死亡細胞和細菌，為組織重建清理壞死區域[8]。中性粒細胞吞噬細菌和細胞碎片后形成中性粒細胞胞外陷阱(NETs)，表達、分泌多種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、巨噬細胞炎性蛋白-1(MIP-1)和趨化因子配體1(CXCL1)參與炎性反應，使單核細胞向損傷或感染部位募集。中性粒細胞不但參與固有免疫反應，還能以細胞因子旁分泌的形式直接或間接作用于DC和淋巴細胞調控獲得性免疫反應[9]。中性粒細胞通過IL-23/IL-17/粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)信號軸調節其自身數目及炎性因子的表達影響局部微環境的炎癥狀態。在G-CSF作用下誘導粒細胞-單核細胞(GMP)增殖，骨髓中增殖、成熟的中性粒細胞在G-CSF的作用下遷入愈合微環境；微環境中的中性粒細胞分泌IL-17或以表達淋巴組織趨化因子(CCL)2和CCL20的方式募集輔助型T細胞(Th)17細胞間接調控IL-17的分泌，IL-17的表達增強可引導DC細胞產生G-CSF進入骨髓中參與IL-23/IL-17/G-CSF信號軸正向調節循環誘導GMP增殖；研究發現巨噬細胞可通過分泌IL-23激活T細胞參與此循環[10]。在持續炎癥條件下，過度激活的中性粒細胞加重組織損傷。

2.2 中性粒細胞影響骨修復

中性粒細胞除了參與啟動炎性反應，還在組織修復方面也發揮著重要作用。中性粒細胞可分泌參與組織修復的蛋白酶如基質金屬蛋白酶9(MMP9)。MMP9是一種促進肌動蛋白、微管蛋白、膜聯蛋白1和高遷移率族蛋白B1等細胞外基質(ECM)和細胞內基質(ICM)成分降解的消化酶[11]。MMP9的高表達有利于清除受損細胞釋放的危險相關分子模式，減輕微環境中因損傷帶來的免疫炎性反應。同時，MMP9可激活血管內皮生長因子(VEGF)促進骨基質中血管新生和成熟，有利于骨組織重建良好血管網。BASTIAN等[12]對閉合性骨折患者不同時間段分離的血腫內容物分析發現：中性粒細胞通過分泌富含合成纖維連接蛋白的ECM促進骨折愈合；在傷后3～5 d，中性粒細胞濃度出現明顯下降；第5天血腫內才出現BMSC，隨著中性粒細胞的消退，BMSC的增多加速了骨愈合過程。表明骨愈合過程中首先進入骨微環境中的是中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等免疫細胞，而不是BMSC。KOVTUN等[13]發現Ly-6G-Ab耗竭小鼠體內中性粒細胞導致小鼠骨愈合明顯受損，血腫內IL-1β、IL-6、IL-10等細胞因子及CXCL1和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的濃度明顯升高，單核/巨噬細胞數量明顯增多。說明早期炎癥階段中性粒細胞的抑制會造成骨愈合受損，強調了早期免疫反應程度和中性粒細胞的募集是啟動下游愈合反應形成良好骨再生的關鍵。

中性粒細胞在調控成骨過程中發揮積極作用，但在一些研究中發現當微環境中存在大量、高濃度的中性粒細胞會導致骨愈合受損。一方面因為中性粒細胞具有廣泛的細胞毒性，可合成、釋放ECM降解酶，如膠原酶、彈性蛋白酶等，特別是當損傷、細菌或感染等刺激激活中性粒細胞后會引起細胞內呼吸爆發，產生超氧陰離子、過氧化氫和次氯酸，這些高細胞毒性的自由基經胞外釋放后可導致組織損傷[14]；另一方面中性粒細胞還可合成腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-17等多種炎性細胞因子抑制BMSC的成骨分化[15]。TNF-α誘導成骨細胞表達RANKL，參與破骨相關信號通路RANKL-OPG-RANK與破骨前體細胞的表面受體——RANK結合，誘導其向破骨細胞分化，造成骨質破壞性吸收；IL-17增強促炎細胞因子IL-6的表達引發炎性反應，誘導巨噬細胞和DC分泌導致軟骨發生吸收的基質蛋白酶，同時可協同TNF-α誘導成骨細胞表達RANKL，增強破骨細胞活化。人中性粒細胞與BMSC共培養，發現高濃度的中性粒細胞導致BMSC細胞數量減少，堿性磷酸酶活性降低。意味著大量中性粒細胞的存在可能通過抑制BMSC合成ECM導致骨愈合受損,表明在早期炎性反應中對中性粒細胞的調控可有效緩解急性炎癥、減少促炎因子的釋放，抑制破骨細胞的活化減少炎性骨吸收促進組織愈合[14]。

2.3 中性粒細胞清除

中性粒細胞完成抗菌功能后發生凋亡，凋亡的中性粒細胞被骨駐留巨噬細胞和DC吞噬、清理。組織中凋亡中性粒細胞的清除有助于炎癥的消退，促進愈合和修復。當巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞后基因會重新編排使其向M2型極化以啟動抗炎反應[16]，其特征是合成轉化生長因子-β(TGF-β)和IL-10，并減少IL-23的合成。IL-23的產生減少導致G-CSF的分泌降低，負向反饋IL-23/IL-17/G-CSF軸減少外周血循環的中性粒細胞數量。中性粒細胞體內生存時間較短，若中性粒細胞死亡后不能被具有吞噬功能的巨噬細胞及時清理，大量堆積的凋亡細胞會擴大中性粒細胞募集信號，導致促炎信號高表達，使局部成纖維細胞增殖、上皮細胞增生形成纖維結締組織導致骨愈合不連，甚至發生繼發性壞死[10,17]。

3 巨噬細胞的雙重調節作用

3.1 巨噬細胞極化調控組織修復

中性粒細胞分泌的IL-6和CCL2招募單核/巨噬細胞到損傷部位，巨噬細胞是一類具有可塑性的先天免疫細胞，在清除壞死/凋亡細胞和入侵的病原體方面起著關鍵作用，促進炎癥消退、組織穩態平衡和損傷修復。巨噬細胞在炎性反應中的表型可隨微環境的變化而發生適應性極化，參與調控下游骨愈合反應。巨噬細胞主要分為M1和M2表型，M1型巨噬細胞分泌一氧化氮、活性氧、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α、IL-1β和γ-干擾素(IFN-γ)等炎性因子，誘導局部炎性反應和促進單核細胞向多核破骨細胞的分化造成骨組織炎性吸收，骨量丟失；M2型巨噬細胞釋放骨形態發生蛋白(BMP)-2、BMP-4、VEGF和TGF-β等細胞因子促進BMSC的募集、成骨向分化、血管成熟和基質沉積[18]，同時增強抗炎因子IL-4、IL-10的表達促進炎癥消退和組織重建；高表達的IL-4通過STAT6通路上調OPG的表達抑制RANKL形成，減輕骨質破壞、促進新骨形成[19]。

損傷后3～7 d急性炎癥逐漸消退，血腫機化形成肉芽組織，肉芽組織內浸潤的大量BMSC在BMP-2、TGF-β等細胞因子的作用下成骨分化為成骨細胞，分泌ECM并逐漸礦化；周圍血管內皮細胞在重組人血小板衍生生長因子-BB和VEGF細胞因子誘導下遷入尚未礦化的細胞外膠原基質中形成新生血管，為骨組織重建血運、促進骨修復[18]。M1巨噬細胞促進BMSC遷移，而M2巨噬細胞明顯增加BMSC活性、增殖和成骨分化，適當的M1/M2比例有利于骨形成。當M1/M2極化平衡出現失調時，過度的M2型極化會引起慢性炎性反應，甚至缺損區被纖維組織包裹，造成骨愈合不連；M1向過度極化將導致炎性反應延長，造成骨組織遷延不愈或不愈合。免疫微環境中巨噬細胞精確極化對良好的骨整合至關重要。缺乏巨噬細胞的小鼠會出現骨骼生長遲緩、骨痂形成較小、基質礦化減少，骨缺損區內新形成纖維組織增多，在骨愈合過程中巨噬細胞對BMSC的調控充當著關鍵作用[20]。

3.2 NACHT、LRR和PYD結構域蛋白3(NLRP3)炎性小體對骨愈合的影響

NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1這3個部分組成，在先天免疫系統中起重要作用。NLRP3炎性小體活化是宿主抵御組織損傷和病原體入侵的第一道防線。NLRP3主要表達于巨噬細胞的細胞質中，但激活的NLRP3炎性小體通常存在于M1巨噬細胞。當受體NLRP3識別病原體相關分子模式或危險相關分子模式，NLRP3與ASC結合激活caspase-1的活化，促進pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌。LATZ等[21]闡述NLRP3炎性小體不僅激活IL-1β的分泌，還促進了其他免疫細胞的募集。依賴于NLRP3的IL-1β的分泌將誘導巨噬細胞極化為致炎表型(M1)，并放大Th1和Th17應答，從而構成連接先天性和獲得性免疫應答的正反饋環路。

炎性小體是促炎細胞因子分泌的關鍵調節因子，NLRP3炎性小體在多種疾病過程中發揮了關鍵作用,包括2型糖尿病、阿爾茲海默癥和動脈粥樣硬化癥等。NLRP3炎性小體作為炎性反應的核心，逐漸成為各種炎癥性疾病治療的新靶點。巨噬細胞中NLRP3炎性小體活化將產生大量IL-1β促進RANKL誘導破骨細胞分化，IL-1β參與多種炎癥相關代謝性疾病、增齡和病理性骨質破壞[22]。最近幾年人們將巨噬細胞內炎性小體的活化與骨重建之間的關系進行了研究。ZANG等[23]在NLRP3炎性小體活化與增齡性牙槽骨丟失的研究中發現：NLRP3炎性小體的抑制可以防止或減少骨量的丟失，其機制可能為巨噬細胞中NLRP3炎性小體的缺乏導致破骨細胞生成減少，減輕了增齡性牙槽骨丟失。在對牙根炎性吸收發生機制的研究中發現，過大的正畸力將促進壓力側牙槽骨及牙周膜內M1 巨噬細胞極化，激活NLRP3炎性小體導致IL-β分泌增加，引發牙根的炎性吸收[24]。對巨噬細胞中NLRP3/caspase-1/IL-1β機制的研究，為以后靶向治療及預防骨吸收提供了新的免疫調節方向。

4 T細胞介導骨愈合

缺乏淋巴細胞的小鼠可能出現骨折愈合延遲或加速愈合兩種相反現象[25]，不同亞群的T細胞在骨修復中發揮各自的功能，其中CD8+T延緩骨折愈合。活化的T細胞增強RANKL、IFN-γ、TNF-α和OPG的表達，RANKL通過RANK-RANKL信號途徑誘導破骨細胞分化，促進骨吸收；IFN-γ誘導Runx2下調并促進TNF-α介導的BMSC凋亡；TNF-α可抑制BMSC中NF-κB信號，將IFN-γ激活的非凋亡Fas轉化為caspase-8/3相關的凋亡信號，導致BMSC凋亡[26]。PACIFICI[27]指出缺乏淋巴細胞的RAG-/-小鼠因微環境中較低的促炎細胞因子濃度加速骨再生。在γσT細胞受體TCR基因敲除小鼠中發現，骨折處產生的炎性細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6水平明顯降低，Ⅱ型膠原蛋白、BSP和BMP-2相關成骨基因表達增加，說明當T細胞缺乏時，小鼠機體低炎性反應有利于骨愈合[28]。

CD4+T細胞可分化為多種亞型的T細胞，根據抗原呈遞細胞(APC)上主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子呈遞給它們的多肽的不同，可以分化為Th1、Th2和Th17亞群。Th1細胞的分化受IL-2、IL-12和IFN-γ的誘導，其主要效應細胞因子是IFN-γ和TNF-α，Th1細胞募集巨噬細胞和誘導B細胞產生IgG；Th2細胞由IL-4誘導分化，其主要效應細胞因子為IL-4、IL-5和IL-13。Th2細胞招募嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞及介導B細胞產生IgE和IgG[29]。Th17細胞是T輔助細胞發育的獨特類型，在急性炎癥早期，Th17細胞可在中性粒細胞釋放的趨化因子CCL2和CCL20作用下向骨愈合區域募集，大量募集的Th17使機體獲得性免疫反應加強，活化的Th17細胞表達IL-17激活DC細胞釋放G-CSF誘導大量中性粒細胞聚集，造成持續性炎性反應，影響BMSC募集及成骨分化，最終導致骨愈合延遲或損傷。DIXIT等[30]使用抗IL-17治療雌性小鼠骨質疏松發現，抗IL-17治療具有抑制破骨細胞活性、促進成骨細胞的增殖和分化、逆轉免疫細胞衰老導致的炎性反應的效果，對卵巢切除小鼠骨量減少有保護作用。對骨微環境中炎性因子IL-17的靶向治療可以促進新骨再生、增強成骨標志物的表達、降低損傷部位的氧化應激。

5 小 結

骨愈合是免疫系統和骨組織相互耦聯、調控的復雜生物學過程，早期炎性反應是它們之間發生聯系的紐帶。損傷或感染激活固有免疫反應、大量免疫細胞遷入微環境啟動骨愈合級聯反應。中性粒細胞作為最早出現的免疫細胞，不僅參與急性炎癥的調節，還通過釋放IL-6和CCL2募集巨噬細胞，微環境中募集的巨噬細胞通過表型間的轉化實現從血管的新生到成熟、從早期的促炎狀態到后期愈合階段的轉變；同時M1型巨噬細胞以分泌細胞因子的形式調控淋巴細胞的活化，誘導更多的趨化因子招募循環系統中性粒細胞的聚集，加重炎性反應影響骨愈合。對骨愈合過程中免疫細胞間協同或拮抗作用的不斷深入研究有希望成為骨免疫學領域中的一個具有巨大發展潛力的研究方向。通過深入認識免疫細胞在骨再生中的生物學意義，可為今后研發具有免疫調節能力的骨替代材料提供了更好的靶向治療思路，以促進骨形成，實現早期和長期穩定的骨愈合，提高植入材料的成功率及骨再生率。