NAD代謝及其底物酶對巨噬細胞極化及功能的影響

陳禹成 綜述，王孟皓，劉作金 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科 400010)

巨噬細胞是先天固有免疫系統的重要組成部分，在炎癥和宿主防御中發揮核心作用。在響應各種環境因素或在不同的病理生理條件下，巨噬細胞轉化為不同的功能表型，即經典活化性巨噬細胞(CAM或簡稱M1)和選擇活化性巨噬細胞(AAM或簡稱M2)[1]。巨噬細胞極化的不平衡通常與各種炎癥性疾病相關，其中，M1型巨噬細胞主要參與炎癥的啟動和維持；M2型巨噬細胞主要參與炎癥的消退[2]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在糖酵解和氧化磷酸化中起核心作用。其接受糖酵解和三羧酸中間產物的高能電子，然后將電子送入電子傳遞鏈(ETC)的復合物Ⅰ，驅動氧化磷酸化，氧化磷酸化是三磷酸腺苷(ATP)的主要來源。NAD也是一種共底物，被蛋白質的共價修飾和信號酶消耗，其底物酶主要為沉默調節蛋白(SIRT)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARPs)、白細胞分化抗原38(CD38)。消耗NAD的酶釋放煙酰胺，煙酰胺可以通過煙酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT)啟動的補救合成途徑重新轉化為NAD。Preiss-Handler途徑是從飲食中的煙酸和煙酸單核苷酸(NaMN)產生NAD，而從頭合成途徑中NAD的合成來自色氨酸[3]。近年來，有研究結果顯示，NAD可以調節巨噬細胞極化[3]。因此，深入研究NAD代謝及其底物酶影響巨噬細胞極化的機制及了解其相互作用，對于闡明炎癥性疾病發病機制和發現新的治療策略至關重要。本文就近年有關NAD代謝及其底物酶影響巨噬細胞極化的機制及其相互作用進行綜述。

1 NAD代謝與巨噬細胞極化的關系

1.1 從頭合成途徑

從頭合成途徑又稱作犬尿氨酸途徑。從色氨酸開始，轉化為犬尿氨酸，最終變成喹啉酸，然后喹啉酸通過喹啉磷酸核糖轉移酶(QPRT)轉化為NaMN進入Preiss-Handler途徑。色氨酸通過吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO1)轉化成犬尿氨酸是從頭合成途徑的關鍵步驟。從頭合成途徑可能促進抗炎極化狀態，阻斷從頭合成途徑使炎性標志物白細胞分化抗原(CD)86和CD64表達升高，抗炎標志物CD206和CD23表達降低，并增加巨噬細胞產生典型促炎因子[生長調節致癌基因(GRO)-α、白細胞介素(IL)-17A、IL-12p40、γ干擾素(IFNγ)、IL-1β、IL-18、IL-2等][3]。

1.2 補救合成途徑

NAD被其底物酶消耗后變為煙酸胺，再經過NAMPT催化后變成煙酰胺單核苷酸(NMN)，NMN通過NMN腺苷酰轉移酶(NMNAT)1、NMNAT2和NMNAT3的催化轉變成NAD完成循環[4]。有研究表明，膳食中的單不飽和脂肪酸正向調控NAD正是通過補救合成途徑達成的[5]。煙酸胺有明顯的抗炎作用，在單側尿道梗阻過程中，煙酸胺能明顯抑制巨噬細胞浸潤、降低促炎因子的表達，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β[6]。NAMPT有兩種不同的形式，細胞內NAMPT(iNAMPT)和細胞外NAMPT(eNAMPT)，其中iNAMPT是哺乳動物NAD搶救生物合成的限速酶[7]。iNAMPT的過度表達會導致巨噬細胞對凋亡的抵抗力增強，使巨噬細胞極化向抗炎的M2型傾斜，同時導致M1型巨噬細胞數量減少，iNAMPT的抗炎作用可能與其上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)有關[7-10]。而eNAMPT通常被認為是一種促炎因子，其在穩態條件下維持巨噬細胞的M1極化，在病理條件下(如白血病)則會成為M2型巨噬細胞的細胞因子[7-8,10]。α-Mangostin是從山竹中分離得到的一種具有生物活性的口山酮，是NAMPT的抑制劑，其介導的NAMPT/NAD的下調有助于減輕巨噬細胞中Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB介導的炎癥[11]。

2 NAD的底物酶與巨噬細胞極化的關系

2.1 SIRT與巨噬細胞極化的關系

SIRT從細菌到人類都是高度保守的，其是NAD依賴的蛋白質脫乙酰酶和(或)單二磷酸腺苷(ADP)核糖轉移酶。哺乳動物含有7個SIRT(SIRT1～7)，它們在催化域和NAD結合域上具有很高的序列同源性。然而，每一個成員的亞細胞定位和催化活性方面都不同。SIRT1和SIRT2依賴于細胞周期和細胞類型的方式在細胞核和細胞質之間穿梭，SIRT3～5是線粒體SIRT，而SIRT6只存在于細胞核中，SIRT7在細胞核和細胞質中均有分布。細胞核SIRT的底物包括組蛋白和非組蛋白，如核轉錄因子和輔助因子，而細胞質和線粒體SIRT在糖酵解、脂肪酸氧化(FAO)、三羧酸循環和其他氧化代謝途徑中涉及關鍵酶的脫乙酰化中發揮重要作用。由于SIRT在全身表達，作為細胞能量感受器發揮作用，并調節廣泛的生理和代謝過程，其活性的失調與各種代謝性、感染性和神經性疾病有關[12]。

2.1.1SIRT1

SIRT1是SIRT家族的創始成員，在維持代謝功能和健康方面起著關鍵作用[13]。SIRT1促進M2型極化可能是由NAMPT-NAD-SIRT1軸進行調節[14]。SIRT1還能使DNA上的炎性位點發生甲基化，限制促炎基因過早激活[15]。有研究表明，SIRT1升高會導致IL-10(M2型巨噬細胞所分泌的抗炎細胞因子)升高，這是因為SIRT1信號通路最終激活IL-10的轉錄因子前B細胞白血病同源盒基因1(PBX1)，挽救因線粒體復合體Ⅲ缺陷所引起的IL-10丟失[16]。此外，SIRT1能夠調節IL-4生成，這可能是SIRT1調節巨噬細胞極化的機制之一[13]。在肝細胞中，SIRT1能通過PPARγ共激活因子-1α(PGC-1α)調節糖酵解和糖異生基因的平衡，并且SIRT1能夠去乙酰化缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)基因啟動子上的組蛋白H3賴氨酸14(H3K14)，從而抑制HIF-1α的表達，進而抑制HIF-1α所介導的增強糖酵解通量[12]、損害巨噬細胞FAO，從而抑制巨噬細胞M1型極化[9]。小檗堿是一種異喹啉生物堿，在中藥中的應用已有數百年的歷史，其通過SIRT1依賴機制抑制NF-κB信號通路，最終有效抑制巨噬細胞炎性反應[17]。此外，SIRT1還是姜黃素的潛在靶點[18]。

2.1.2SIRT2

SIRT2是一種依賴NAD的組蛋白去乙酰化酶，在腫瘤發生、基因組不穩定和細胞周期進展中起作用。有研究表明，SIRT2通過調節巨噬細胞極化來調節腎臟損傷的局部炎癥過程，并防止結腸炎的發展[19]。SIRT2也能直接與HIF-1α結合，使其去乙酰化和失活，從而促進巨噬細胞M1型極化[12]。并且SIRT2同SIRT1一樣，能使DNA上的炎性位點發生甲基化，限制促炎基因過早激活[15]。在小鼠模型中，敲除SIRT2不影響免疫細胞發育，對巨噬細胞影響小，但能增強巨噬細胞的吞噬作用[19-20]。

2.1.3SIRT3

SIRT3是一種依賴NAD的脫乙酰酶，對代謝狀態敏感，介導適應性反應。SIRT3能夠降低活性氧生成，減少細胞自噬，降低核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性小體活性[21]。在SIRT3敲除的小鼠中使用viniferin(SIRT3激活因子)，能夠抑制NLRP3炎癥激活為特征的促炎癥表型[22]。當SIRT2與SIRT3同時敲除時，比起糖酵解巨噬細胞更傾向于FAO，但并未改變內毒素抗性，其中機制有待進一步探究[23]。

2.1.4SIRT6

SIRT6是一種NAD依賴性脫乙酰酶，在DNA修復、炎癥和脂質調節中起著關鍵作用。SIRT6敲除的小鼠表現出嚴重的代謝缺陷和加速衰老，并且SIRT6過表達時會減少巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白攝取[24]。SIRT6還通過H3K9的去乙酰化來調節葡萄糖穩態，以抑制各種HIF-1依賴性糖酵解基因的表達，或許能夠抑制巨噬細胞M1型極化[9,12]。

2.2 PARPs與巨噬細胞極化的關系

PARPs超家族歷史上被分類為一組包含PARP結構域的蛋白質，由17種結構相關蛋白質組成，其中6種擁有明顯催化活性，PARP1、PARP2、PARP3、PARP4(也被稱為vault PARP)、端錨聚合酶1(TANK1,也被稱為PARP5A)及TANK2(也被稱為PARP5B)。超家族其他成員，PARP6、PARP7(也被稱為TIPARP)、PARP8、PARP9(也被稱為BAL1)、PARP10、PARP11、PARP12、PARP13(也被稱為ZC3HAV1)、PARP14(也被稱為BAL2)、PARP15(也被稱為BAL3)及PARP16[25]。PARPs促進ADP-核糖基化，這是翻譯后修飾(PTM)的基礎之一。這種無處不在的PTM調控著各種關鍵的生物學和病理過程，包括DNA修復、細胞分化、基因轉錄、信號轉導途徑、能量代謝和表觀遺傳學[26]。

2.2.1PARP1誘導巨噬細胞活化及炎癥

PARP1與巨噬細胞或巨噬細胞樣細胞系對病原體相關分子模式(包括脂多糖)的反應機制有關。PARP1的磷酸化導致NF-κB亞單元p65/RelA的PAR化，從而誘導NF-κB調節基因的轉錄[27]。PARP1還誘導巨噬細胞中的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)從細胞核釋放到細胞質，這需要它的PAR化和隨后的乙酰化[28-29]。PARP1還對其他與巨噬細胞相關的細胞類型，如脂肪肝中的Kupffer細胞和受損腦中的小膠質細胞發揮促炎作用[30-31]。

2.2.2PARP9與PARP14調控巨噬細胞活化

有研究表明，在體外實驗的人原代巨噬細胞中，PARP14抑制促炎的IFNγ-轉錄激活因子1(STAT1)通路并激活抑炎的IL-4-STAT6通路。以siRNA沉默PARP14可加快被IFNγ處理的巨噬細胞產生促炎細胞因子和趨化因子，抑制經IL-4處理的細胞生成抗炎因子。而沉默PARP9通常效果相反，PARP9似乎干擾了PARP14對IFNγ-STAT1通路的抑制作用，從而促進促炎巨噬細胞的激活[32]。

2.2.3其他PARPs在巨噬細胞中的作用

雖然上述研究報道了PARP1、PARP9和PARP14如何通過信號通路促進或抑制巨噬細胞的激活，但關于其他PARPs在巨噬細胞中有何作用的研究仍然很少。有研究表明，脂多糖可增加小鼠骨髓來源的巨噬細胞中PARP3、PARP4、PARP7、PARP8、PARP10、PARP11、PARP12和PARP13的mRNA表達，但這些PARPs在巨噬細胞中的功能尚不清楚[33]。已有研究將PARP10和PARP12與NF-κB信號聯系起來[34-35]。雖然上述研究提示除PARP1、PARP9和PARP14以外的PARPs在巨噬細胞中可能存在作用，但還需要更多的研究來探明這些PARPs參與巨噬細胞活化與炎癥的具體機制。

2.3 CD38與巨噬細胞極化的關系

CD38是一種多功能細胞外酶，代謝NAD并且調節NAD、細胞外核苷酸穩態及細胞內鈣[36]。CD38主要表達在免疫細胞上，以響應細胞因子、內毒素和干擾素的刺激[37-38]。該酶的表達受一個包含NF-κB、視黃酸X受體(RXR)、肝X受體(LXR)和STAT結合位點的啟動子區域的調控，并且巨噬細胞在M1極化時表達CD38，這表明它在炎性反應中起著關鍵作用[38]。在細胞/組織衰老過程中NAD的下降與暴露于衰老相關的分泌表型(SASP)相關的因素有關，SASP可能會增加這些細胞/組織中CD38的表達。衰老細胞的SASP條件培養液可以誘導巨噬細胞和內皮細胞表達CD38。因此，衰老的表型可能驅動CD38+炎癥細胞的積累，而CD38+炎癥細胞調節NAD前體的可獲得性，并發揮作用在煙酰胺核苷酸代謝中的重要作用[39]。

2.4 其他NAD依賴且影響巨噬細胞極化的途徑

2.4.1乳酸脫氫酶(LDH)A

LDHA是一種重要的酶，通過有氧糖酵解途徑參與多種腫瘤的生長和能量代謝。LDH是由4個亞基組成的四聚體酶。最常見的兩個亞基是LDHA和LDHB，已知的LDH同工酶有5種：LDH-5，A4；LDH-4，A3B1；LDH-3，A2B2；LDH-2，A1B3；LDH-1，B4。LDH-5是催化丙酮酸轉化為乳酸的最有效的同工酶。在天然產物庫中的480個化合物中，對LDHA酶活性的抑制作用最強的是楨楠素A，該化合物通過阻斷LDHA的NAD結合位點而起到競爭性抑制劑作用。楨楠素A處理的癌細胞，會減少瘤源性乳酸產生，并抑制精氨酸酶1(Arg-1)表達，進而抑制巨噬細胞M2型極化[40]。

2.4.2嘌呤能G蛋白偶聯受體(GPCR)P2Y11

P2Y11受體是GPCR P2Y家族的1個非常規成員，目前由8個成員組成(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13和P2Y14)。P2Y11受體與磷脂酶C和腺苷酸環化酶結合，優先被ATP激活。NAD是代謝和炎癥過程的另一個關鍵調節因子。IL-10通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-NAMPT-NAD信號軸，在M2c分化過程中誘導P2Y11上調。NAD及其直接前體NMN可以在NAMPT抑制過程中使P2Y11受體恢復，可能是通過激活SIRT1來實現這一點。并且P2Y11受體能增強Ras介導的細胞外信號調節激酶(ERK)與IISB激酶(IKK)效應通路的激活誘導的IL-8生成[41]。

2.4.315-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)

15-PGDH是NAD依賴性的，能催化前列腺素E2(PGE2)的15(S)羥基的氧化，將促炎癥的PGE2轉化為抗炎的15-酮-PGE2(PPAR-γ的內源性配體)。15-PGDH能在Kupffer細胞中激活PPAR-γ，而PPAR-γ的激活增加了IL-4 促進了巨噬細胞向抗炎性極化[9,42]。

3 展 望

巨噬細胞是免疫系統中功能非常復雜的細胞，并且與疾病的發生、發展息息相關。巨噬細胞會根據環境的不同，極化為M1型巨噬細胞或者M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞能吞噬并消滅外來的病原體，促進炎癥的發展，加速細胞外基質降解與細胞死亡啟動Th1型免疫應答；M2型巨噬細胞能促進組織修復和傷口愈合，抑制T細胞增殖與活化，調節Th2型免疫應答。同時這兩種極化狀態的作用也互相拮抗，它們極化的不平衡在腫瘤、缺血再灌注損傷當中起著重要作用。因此，NAD代謝及其底物酶能夠調節巨噬細胞極化，干預巨噬細胞在M1型極化與M2型極化間轉換對各類炎性疾病的治療與預防有重要意義，進一步深入研究NAD代謝及其底物酶影響巨噬細胞極化的詳細機制，對解決腫瘤發生及缺血再灌注損傷有著重要作用。