組蛋白去乙酰化酶4在缺血性卒中失調的研究進展*

劉 丹，楊錫彤 綜述，王光明審校

(大理大學第一附屬醫院基因檢測中心，云南大理 671000)

卒中是我國人口常見死亡原因之一，也是全球人口第二大死亡原因，具有高發病率、高病死率、高致殘率、高復發率及并發癥多等特征，其與冠心病和癌癥并列為威脅人類健康的三大疾病，通常被分為缺血性卒中和出血性卒中[1-2]。缺血性卒中是各種原因導致腦部血液供應障礙，局部腦組織缺血、缺氧性壞死而出現相應神經功能損傷的一類臨床綜合征，其發病率可占所有卒中的70%～80%。研究發現，約1/3的缺血性卒中患者會在發病后立即死亡，另有10%～15%的患者在1年內死亡，其余幸存的患者有近80%的可能會伴有各種神經功能缺陷[3]。近年來由于醫學的進步，卒中患者的病死率逐步降低[4]。但是，在幾十年的研究進程中，臨床對于缺血性卒中的治療仍停留在溶栓和癥狀控制方面。因此，對缺血性卒中的發病機制及治理干預等進行深入研究顯得尤為重要。卒中的病理生理過程受多種因素影響，其中炎癥和遺傳在卒中的發病過程中起著重要作用。本文就表觀遺傳學在缺血性卒中的治療進展作一綜述。

1 組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的生物學特征

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一類在真核生物(包括酵母、哺乳動物和植物)中廣泛存在的超基因家族。HDACs是一大類酶，通過催化作用從組蛋白尾賴氨酸殘基中去除乙酰基，調節組蛋白乙酰化水平，基于功能和DNA序列的相似性被分為4個不同的亞類(Ⅰ～Ⅳ)[5]。Ⅰ類HDAC家族由HDAC1、2、3和8組成；Ⅱa類HDAC由HDAC4、5、7和9組成，HDAC6和HDAC10構成Ⅱb類HDAC家族；Ⅲ類即沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，SIRT2)；HDAC11是唯一的Ⅳ類HDAC。HDAC4在大腦中高度表達，神經元活動依賴于HDAC4的核質穿梭。HDAC4是一種大蛋白，具有延伸的N端調節結構域和C端尾[6]。Ⅱa類HDAC的核-細胞質穿梭是一種依賴突觸活性和核鈣的機制，對海馬神經元信號調控基因表達的表觀遺傳調控非常重要。尤其是HDAC4在突觸結構和可塑性重要基因的調控作用中有著密切的聯系[7]。在鈣離子流入的反應中HDAC4被激酶磷酸化，如鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶Ⅳ(CaMKⅣ)，其是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可磷酸化HDAC4，HDAC4的磷酸化使其能夠隨后與14-3-3蛋白結合，從而導致HDAC4的核輸出[8]。HDAC4還可能通過促進血管生成、神經再生來抑制神經元死亡，從而在卒中的發生、發展過程中起著重要作用。

越來越多的證據表明，表觀遺傳修飾在應激神經元的存活/死亡中起著關鍵作用[9]。表觀遺傳學是分子生物學的一個分支，研究能夠在不改變DNA序列的情況下改變基因表達的修飾，可以調節生物體內發生的不同生理過程，表觀遺傳調控包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等，近年來發現表觀遺傳與缺血性卒中在內的心血管疾病的發病機制有關，重要的是，由于表觀遺傳修飾是可逆的過程，因此它可以用來探究新的治療方法[10-11]。在表觀遺傳的調控中組蛋白乙酰化是最常見的過程，組蛋白乙酰化在正常細胞過程中起著重要的調控作用，受HDACs和組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)的調控[12]。HATs和HDACs是一對拮抗酶，通過乙酰化和去乙酰化組蛋白調節基因的表達。HATs在組蛋白的“尾巴”上乙酰化賴氨酸殘基，而HDACs則去除乙酰基。HDACs是一種去除組蛋白和非組蛋白乙酰基的酶[13]，通過去除乙酰化組蛋白尾中的特定賴氨酸殘基，HDACs使染色質凝聚和基因抑制[14]。

2 缺血性卒中發生及卒中后恢復的機制

缺血性卒中由腦動脈閉塞引起，卒中發生的幾分鐘內血液供應被迅速抑制。缺氧和葡萄糖不足導致三磷酸腺苷(ATP)耗竭和神經組織梗死[15]。最終的梗死面積和神經結局取決于多種因素，如缺血的持續時間和嚴重程度、側支系統的存在和足夠的全身血壓、梗死的病因和定位，同時也取決于患者的年齡、性別、遺傳背景及相應多藥治療的并發癥等因素[16]。因此，卒中是一種復雜且具有異質性的疾病。卒中后的血管生成、神經發生等都與缺血事件后大腦的恢復有關。

2.1 細胞損傷

缺血性卒中由大腦動脈阻塞引起，其損傷過程從梗死核心向周圍組織擴散。卒中發生后，血液急劇減少到15%以下，形成缺血區的中心區域，而缺血區的周圍區域(缺血半影區)血供較中心區高。卒中發生后幾分鐘內就會出現壞死，因此核心區域無法被挽救，但是半影區細胞通過適當的干預可以被挽救。梗死周圍區域(危險區域/缺血半暗區)的組織損傷發展較慢，持續數小時，這一治療窗口為細胞保護提供了時間[17]。通過阻斷有害的通路，可減少半影區細胞凋亡和損傷，改善卒中治療潛力。

2.2 血管生成

血管生成在人體生理過程中起著核心作用，從生殖和胎兒發育到傷口愈合和組織修復/再生。血管生成在內源性再生機制中具有良好的臨床意義[18]。梗死周圍微血管密度增加與缺血性卒中患者更長的生存時間有關，并可以改善缺血性動物模型的預后。表明增強血管生成可能是促進缺血性卒中后功能恢復的策略之一。血管和神經元細胞通過各種介質相互交流，并作為一個單位參與腦缺血的病理生理過程[19]。缺血性卒中后血管生成有利于中樞神經系統缺血半影區腦血流的恢復，對缺血性卒中患者的長期恢復有良好的影響。如果在短時間內缺血半影帶血流恢復，則該區域腦組織的損傷是可逆的，神經細胞有可能存活并恢復功能。

2.3 神經再生

神經發生有助于卒中后的恢復[20]。血管生成和神經生成是相互關聯的神經修復機制，卒中所致損傷可誘導梗死區半暗帶的神經發生。卒中發生后腦血流突然減少導致缺氧，從而引發興奮性毒性、氧化應激和神經炎癥。有證據顯示，腦缺血后中樞神經系統存在內源性神經發生過程的增強，即靜止的神經干細胞(neural stem cells，NSC)被激活，之后分化增殖成神經前體細胞和神經母細胞，并遷移至損傷腦區如紋狀體、大腦皮質及原位海馬分子層，通過在損傷區產生新生神經元來修復受損腦組織。這種成體大腦的自我修復機制，對腦缺血的恢復具有實質性影響。缺血損傷可在一定程度上激活內源性NSC。缺血發生后，側腦室腦室下區和齒狀回顆粒下區存在的神經前體細胞增殖并向病變區遷移，促進腦修復[21-23]。增強由缺血驅動的內源性神經發生，促進新生神經元的存活，是具有前景的卒中治療干預措施。此外，以干細胞為基礎的治療有助于神經再生和患者的神經恢復。然而，干細胞在逆轉癥狀方面的作用模式尚不清楚，在建立卒中干細胞治療之前，尚需明確給藥的干細胞類型、干細胞數量、用藥時間、是否需要劑量增強劑、給藥途徑等臨床參數。盡管干細胞治療仍處于發展階段，但對卒中患者的神經康復具有巨大的潛力[24]。

3 HDAC4在缺血性卒中的作用機制

3.1 HDAC4在神經元中的作用

卒中會導致腦梗死周圍皮層神經元中HDAC4的核穿梭，表明核仁HDAC4的增加與神經元重構密切相關，但與神經元細胞凋亡無關。HDAC4在促進缺血性損傷后神經元恢復中具有重要作用[25]。在缺血性卒中模型小鼠/ats和氧-葡萄糖剝奪(OGD)處理的神經元中觀察到HDAC4核穿梭增加，而鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)的過度表達降低了核HDAC4水平[26]。實驗表明，CaMKIV的基因缺失能夠增加卒中后小鼠HDAC4的細胞核積累，CaMKIV的過表達降低了缺血后細胞核HDAC4的水平。此外，當HDAC4被抑制時，CaMKIV過表達提供的神經保護作用在 OGD 模型中缺失。以上y研究提示，CaMKIV 是缺血中 HDAC4 的上游調節劑[27]。HDAC4易位是卒中后神經元死亡的關鍵調節步驟，在缺血條件下，CaMKⅣ控制神經元中細胞核和細胞質之間的HDAC4平衡。

3.2 促進血管再生和神經發生

越來越多的證據表明，缺血性卒中后的血管生成對于卒中預后有極大的影響。血管生成受多種生長因子共同調控，是多種相關基因多步驟協同作用的共同結果。缺氧誘導因子-l(hypoxia induciblefactor-1,HIF-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是研究較早的廣泛應用于缺血性疾病研究的調控因子[28]。研究證明，HDAC4存在多個磷酸化位點,卒中后HDAC4的磷酸化明顯上調，能夠從細胞核轉移至細胞質，激活下游與血管相關基因的表達，而抑制HDAC4磷酸化可顯著降低缺血腦組織的血管生成反應。腦缺血后4～7 d，缺血核心和周圍邊緣血管新生，缺血皮質區HIF-1α和VEGFa表達明顯上調，同時伴隨HDAC4蛋白磷酸化水平的明顯變化[19，28]。表明HDAC4的磷酸化對腦缺血后血管生成至關重要，HDAC4對血管生成的調節作用可能是通過調節HIF-VEGF信號來實現的，提示在卒中有新的治療靶點[6]。HDAC4可能通過調節多個分子的表達和功能促進神經發生，如微RNA-9(miRNA-9)，miRNA-9是一種神經元特異性miRNA，是神經發生的重要調控因子，只有3個基因組位點中的一個能夠編碼miRNA-9，而其中Mef2具有親神經作用。在四個Mef2旁系同源物中，有研究發現僅Mef2在神經發生過程中受到調控，在分化過程中，Mef2C 通過結合上游調節位點來激活miR-9-2(miR-9-2是分化神經元前體中主要受調控的 miR-9 位點)從而導致 miR-9 表達增加，反過來，增加的 miR-9 水平有助于減弱Mef2的抑制劑HDAC4，這樣看來miR-9對 HDAC4的抑制強化了正反饋方案，該方案增強了神經前體細胞的神經發生功能，促進神經再生[29]。此外，研究發現逆轉miR-9水平可以抑制中腦動脈栓塞(MCAO)模型和糖氧剝奪(OGD)離體腦缺血模型中的神經元的凋亡[30]。通過上調miRNA-9，有助于缺血性卒中后神經元的存活和再生。而HDAC4失活在體外能積極調節miRNA-9的表達，減輕缺血損傷[31]。一項研究表明，HDAC4是絲裂原活化蛋白激酶7(MAP Kinase Kinase 7，MKK7)轉錄和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)激活所必需的，MKK7是JNK上游激酶，HDAC4特異性抑制劑LMK235劑量依賴性地抑制MKK7轉錄和JNK/c-Jun活性，通過LMK235抑制HDAC4顯著挽救了鉀剝奪誘導的小腦顆粒神經元(CGN)細胞凋亡,與MKK7轉錄、JNK/c-Jun活性和神經元凋亡的明顯減少相關,HDAC4在神經元凋亡中起著重要作用[32]。

4 卒中的治療現狀及HDAC4在卒中治療中的應用

缺血性卒中是致死和致殘的主要原因之一，缺血性損傷和細胞凋亡的演變在幾分鐘、幾小時甚至幾天內持續，促進血管再生和神經發生成為治療缺血性卒中的候選方法。目前普遍認為實現早期缺血部位血流再灌注為救治該類患者的有效手段，但存在明顯的局限性：(1)可實現缺血部位血流再灌，恢復缺血部位功能，緩解病情；(2)易引發腦缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury, I/RI),使病情進一步加重。

HDACs是卒中治療的潛在靶點[5]。已被證明在動物模型中，一般的HDACs抑制劑(HDACi)可以預防腦缺血。有報道證實，組蛋白去乙酰化酶超家族抑制劑可誘導細胞周期阻滯、觸發細胞死亡和減少血管生成，是一種很有前景的靶向表觀遺傳調控基因表達的抗癌藥物[33]。其中有幾種HDACi已被美國食品與藥品監督管理局(FDA)批準用于癌癥的臨床應用[34]。HDACs被認為具有神經毒性和神經保護作用，并且部分依賴于其亞細胞分布，HDACi在治療包括癲癇在內的各種神經系統疾病方面也有著悠久的歷史[35]。HDACi可保護卒中后的神經細胞。在光血栓梗死(PTI)后期小鼠的缺血核心周圍組織中感覺運動皮層和對側半球相應區域內，觀察到皮質神經元HDAC4的減少和核移位的增加[36]。這也將會成為卒中后治療的新的靶點。目前臨床還沒有關于HDACi的藥物應用于缺血性卒中，而且有關HDAC4用于卒中治療的效果研究也僅限于大鼠、小鼠的卒中模型，還要進一步進行臨床前研究。同時，也需要評估HDAC4 用于卒中治療的效果和安全性。

5 小 結

HDAC4在卒中的發生、發展過程中具有重要作用，可能通過促進血管生成、神經再生來抑制神經元死亡。通過調節HDAC4可以促進HIF-VEGF信號下游靶基因的表達，上調miRNA-9促進血管生成，以及神經發生來干預神經元死亡。雖然大多數的研究都是在動物模型中完成，但是許多調節HDAC4水平的方法可應用到臨床中，如上調miRNA9的表達水平來抑制HDAC4。因此，調節HDAC4表達可能轉化為臨床用于治療缺血性卒中的有效方法，但仍然需要大量的臨床研究評估其療效和安全性。