影響熒光定量PCR實驗準確性的因素剖析

李世鳳

(民樂縣畜牧獸醫工作站,甘肅 民樂734500)

近年來，尤其是H7N9流感及非洲豬瘟疫情爆發后，熒光定量PCR診斷方法在基層動物疫病防控、檢疫檢驗、流行病學調查和疫病診斷中的優勢越來越凸顯。PCP方法因其敏感性高、操作簡單、診斷周期短、準確性高的特點，已經成為基層畜牧獸醫業務部門最主要的診斷手段之一。

如何在最短的時間內做出最準確的判斷就顯得尤為重要。熒光定量PCR實驗必須在二級生物安全水平以上實驗室內、由技術過硬的專業人員精準操作下完成。因此，本文從以下3個方面，簡單分析影響實驗精準性的因素。

1 二級生物安全實驗室的運行基本要求

1.1 實驗室的選址要求

實驗室選址不僅要符合國家、當地的環境保護部門要求，也要復符合建設主管部門的要求。首先要了解這些要求并征得其部門同意和批準，方可進行實質性的設計和建設，不要盲目選址建設。要根據當地四季溫差、風向、溫度變化范圍、空氣濕度等自然條件，建在相對地勢較高、僻靜、交通相對便捷的地方。

1.2 實驗室建設要求

選址完成之后，建議請專業的實驗室設計人員，根據現有的條件，設施設計和規劃建設實驗室，充分考慮未來實驗室的使用方向和可能的發展趨勢。建設原則要符合各區獨立、注意風向、因地制宜、方便工作的原則。硬件設施要求越完善，越有利于運行管理。我縣的獸醫實驗室建在原民樂縣畜牧獸醫局辦公樓一樓，與辦公區域獨立分開，建設之前就在民樂縣環保局的備案。

1.3 建立完善的質量管理和生物安全管理體系

一個合格的獸醫實驗室必須要有規范的質量管理體系和生物安全管理體系并且嚴格執行。我縣獸醫實驗室制定了完善的質量手冊、生物安全手冊、程序文件等，建立了嚴格的管理體系。

1.4 過硬的人員隊伍

獸醫實驗室管理人員必須要有防范大于治理的安全意識，把好質量安全和生物安全關。技術人員要掌握必要的理論基礎、積累一定的實驗室工作經驗并且掌握熒光定量PCR實驗工作原理、熟悉儀器設備、掌握不同試劑原理，最好人員隊伍固定。我縣獸醫實驗室現有專職實驗室工作人員3名，均在5年以上的實驗室工作經歷，都具備中級以上職稱。

1.5 合格的硬件設施及輔料

熒光定量PCR實驗對硬件設施要求高，必備的生物安全柜、離心機、移液器及常用的一些輔助試劑和耗材(采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等)必須符合基本要求。

民樂縣動物疫病預防控制中心獸醫實驗室在2004年農業部動物防疫基礎設施建設項目和2017年獸醫實驗室能力提升建設項目的基礎上，對獸醫實驗室進行了改擴建。目前建筑面積達458平方米，設有解剖室、接樣室、檔案室、無菌室、血清學檢測室、病原學檢測室、分子生物學實驗室七個功能室。2020年5月通過甘肅省獸醫局的授權，開展非洲豬瘟熒光PCR檢測，止目前共檢測34批次2691份樣品，涵括血清、環境樣品、生豬運輸車輛及組織等。樣品覆蓋全縣的規模養豬場(戶)、生豬定點屠宰廠、輛運輸車輛。同時開展口蹄疫病毒及H5、H7流感病毒的檢測，累計完成3469份樣品的分子生物學檢測實驗。

2 樣品的采集、處理、保存和運輸

實驗樣品采集遵循適時、合理、典型、無菌、安全的原則。采集樣品時要根據不同的疾病或者檢驗目的，采集相應的臟器、內容物、分泌物、排泄物等，樣品要有代表性；同時做好自我安全防護，以免造成不必要的損傷。采樣結束后做好包裝、運送和記錄工作。并在最短的時間內送檢。

樣品的采集、處理、保存和運送時檢驗工作順利開展的基礎，樣品決定了實驗結果的可靠性。所以說樣品的采集、處理、保存和運送是十分重要的。具體采樣要求建議參考原農業部2002年8月頒布的“動物疫病實驗室檢驗采樣方法(NY/T541-2002)”。

3 人為因素

對于基層獸醫檢測人員來說，在實驗室已經建設好、現有的硬件設施及實驗室的輔料，影響實驗結果準確性最主要因素的是實驗過程的各種人為因素。筆者從事多年的基層獸醫實驗室工作，認為在現有的條件下，以下幾個方面是提高實驗準確性的關鍵環節。

3.1 實驗準備工作

實驗前的準備工作十分重要，但往往卻經常被忽視。首先要根據委托協議查看實驗目的，準備耗材、提前開啟儀器設備保證正常運行、所需試劑回溫及耗材查漏補缺等必備工作。其次檢查待檢樣品是否符合實驗要求，如符合須先處理樣品(包括置盲、留樣及滅活、稀釋等前期工作)，實驗前樣品處理(樣品滅活)可避免污染實驗室的現象發生，留樣是復檢的前提。

3.1.1 確定耗材及以前配件是否使用正確 耗材對于熒光定量PCR來說比較重要，很多異常擴增曲線是由于耗材使用不當引起的。常見的有錯誤使用普通PCR儀器所對應的耗材，透光性太差，可能會出現打折的曲線。沒有選擇跟儀器加熱模塊規格匹配的耗材。造成反應管外壁與熒光定量PCR儀器溫控模塊沒有充分接觸，熱傳導不充分進而影響酶的活性，出現假陰性的結果。使用質量差的耗材可能出現熒光值不穩定得到的CT值不穩定。

3.1.2 確認所有試劑是否正確 確認試劑是否有效，核查有效期、運輸條件、是否反復凍融等。若以上任何一項不符合，建議廢棄不用以免影響實驗準確性。

3.2 實驗過程

實驗過程簡單的說就是按照試劑說明書完成核酸提取、體系配制、擴增分析三個過程。其中最關鍵的環節核酸提取、體系配置。整個過程需要在獨立的區域內(即準備區、配置區、擴增分析區)、按照單向移動(潔區到污區)的原則完成。

這個階段要求實驗室工作人員手穩、手快、心細。我認為熒光定量PCR實驗的以下操作細節要特別注意：

3.2.1 從冰箱冷凍取出的試劑是否混合均勻 提取核酸加樣是否精準、倒廢液的時候是否污染了手套及操作臺面、離心管蓋是否蓋嚴實、離心過程進來避免甩開管蓋等。

3.2.2 擴增之前加樣是否精確 有沒有掛在八連管管壁、八連管蓋密閉性檢查、八連管與PCR儀有沒有充分接觸、八連管內有沒有氣泡等等。

3.2.3 確認軟件設置是否正確 對照試劑盒說明書，檢車時間、溫度、循環數、熒光采集等設置是否正確。

如果以上都正常，一般來說不會出現異常的擴增曲線。但是個別情況下還是會出現，這就要求實驗室工作人員具備判斷數據結構的能力，為什么會出現異常曲線以及怎么避免出現異常曲線。

3.3 實驗室去污染和廢棄物處理

實驗結束后對樣本、設備、操作臺面及操作間等進行清潔、消毒、滅菌是最后環節。結合本人工作實際，PCR實驗廢棄物經過高壓滅菌之后，交于醫療廢棄物處理機構統一處理。操作臺面、生物安全柜、移液器、試管架等硬件設施通過84消毒液噴灑--核酸去除劑噴灑--酒精擦拭三步法，輔以紫外燈照射徹底消毒。為下次實驗做準備。

綜上所訴，在實驗室建設運行情況良好的情況下，符合樣品符合檢測要求、技術過硬的工作人員三個必備條件下，注意操作細節，選用合適的耗材及輔料，嚴謹細致的工作態度，才能克服影響因素從而大大提高實驗準確性，為快速準確的判斷疫情、檢疫檢驗結果提供判斷依據。