循環腫瘤細胞在肺癌精準醫療中的研究進展

李欣 周倩 綜述 唐小葵 審校

肺癌每年新發病率約占全部腫瘤的12%，死亡人數占癌癥總死亡人數的20%左右，是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌治療的傳統方式是手術、化療、放療，隨著分子診斷的發展，靶向和免疫治療成為肺癌治療的新選擇，肺癌患者診斷后的生存率也逐漸提升。隨著精準醫學的提出，肺癌的研究已逐漸深入分子層面，這有利于對不同患者進行分層以實現個體化醫療。傳統的分子檢測在實體組織中進行，但近年來基于血液的循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測已成為具有前景的檢測手段。

CTCs 是自腫瘤原發病灶或轉移病灶脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，因此，CTCs 基因表達和基因突變圖譜可以反映原發性和轉移性腫瘤成分[2]。與傳統組織學活檢相比，CTCs 檢測具有創傷小、可重復檢測的優勢，可動態提供患者疾病信息。既往研究多局限于CTCs 計數，現在對于CTCs 的研究已深入基因組譜、轉錄組譜、蛋白代謝物如程序性細胞凋亡配體-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）等成分，并且可進行單細胞分析以描述腫瘤異質性特征、進行細胞培養或建立CTCs 來源的異種移植物（cell-derivede xplants，CDX）模型以實現藥物篩選等[3-4]。本文將對CTCs 在肺癌精準醫學中的研究進展進行論述，從指導治療、揭示轉移機制、評估PD-L1 表達等方面展開。此外，同為液體活檢技術的循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測，已成為檢測肺癌治療靶點的常用臨床手段，本文也將探討CTCs 與cfDNA 在肺癌診治中聯合應用的價值。

1 指導肺癌藥物治療

1.1 細胞體外培養及CDX 技術與藥物

CTCs 作為完整的細胞，可在體外進行細胞擴增以進行臨床前藥物測試。Zhang 等[5]在1 例ALK 基因重排的肺腺癌患者中，對獲得的CTCs 進行檢測，發現ALK 基因上的L1196M 發生耐藥性突變，進一步對CTCs 進行體外擴增，比較兩種間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitor，ALK-TKI）克唑替尼和塞瑞替尼的藥物敏感性，表明塞瑞替尼療效更突出。CTCs還可以在免疫缺陷小鼠中構建CDX 模型，用于臨床前藥物測試及耐藥機制的分析。Lallo 等[6]通過CDX模型構建了針對小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的臨床前模型，在CDX 模型中，多聚ADP 核糖聚合酶抑制劑奧拉帕利聯合Wee1 抑制劑AZD1775 的疾病控制時間較順鉑聯合依托泊苷更長。CDX 模型為探究新的治療方法提供了機會，但CDX的成功構建通常要求較高的CTCs 數量，常用于高侵襲性的SCLC，而在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的應用較少，但Morrow 等[7]通過晚期NSCLC 患者的間質性CTCs 成功構建CDX 模型，這也證明了間質CTCs 的致瘤性。總體來說，CDX模型在藥物選擇及新藥物研發方面具有一定價值。

1.2 預測SCLC 化療耐藥性

SCLC 的化療耐藥是臨床治療的一大難題。Su等[8]對48 例SCLC 患者的CTCs 進行單細胞測序，依據拷貝數變異（copy number alterations，CNAs）建立評分系統以評估SCLC 患者初始化療療效。與高CNA患者相比，低CNA 患者在一線化療后無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）顯著延長，表明不同CNA 水平的CTCs具有預測SCLC 患者的化療療效的潛能。同樣，Carter 等[9]從6 例化療耐藥及7 例化療敏感的SCLC患者中分離出88 個CTCs，對CTCs 進行全基因組擴增，建立基于CNA 的化療耐藥預測模型，該模型在另外18 例患者的CTCs（112 個）和基于6 例SCLC 患者的CDX 中得到驗證，根據CNA 將SCLC 患者分為化療敏感性或化療難治性，分組的準確率達到83.3%。上述研究表明，通過CTCs 能發現不同患者間遺傳模式的差異，可用于探究產生藥物耐藥的機制，并推動個性化治療的進步。

1.3 預測肺癌預后

多項大型隊列研究均表明晚期肺癌患者中外周CTCs 的高基線計數及計數升高與預后不良相關[10]，并有薈萃分析表明，基線CTCs 計數與腫瘤分期、淋巴結轉移和預后顯著相關[11]。但由于不同CTCs 表型的預后不同，不同檢測方法制定的截斷值不同，尚未對CTCs 的截斷值進行標準化，無法確保結果的可重復性。

2 揭示腫瘤轉移機制

單細胞測序能深入探索細胞與細胞之間的異同，揭示特定CTCs 亞群與腫瘤轉移的相關性。Ni 等[12]對肺癌患者外周血單個CTC 進行全基因組擴增和測序，在肺腺癌和SCLC 患者中均發現來自相同患者的不同CTCs 展現出高度一致的全基因組拷貝數變異（copy number variation，CNV），并且和同一患者的轉移腫瘤組織的CNV 一致，但區別于原發腫瘤。該研究還發現不同肺腺癌患者的CTCs 中CNV 具有高度的相似性。異質性是惡性腫瘤的重要特征，在CTCs中觀察到的高度一致的CNV 模式提示，特定的CNV在腫瘤形成及轉移中發揮重要的作用。同樣，Gao 等[13]的研究也發現，原發病灶腫瘤細胞的CNV 經歷不同的中間狀態逐步積累，最終單個CTC 與轉移病灶組織表達相同的CNV 模式，這表明腫瘤的轉移過程存在基因組拷貝數變化的趨同選擇，有助于了解癌癥轉移機制。

不同表型的CTCs 的侵襲性也存在差異，上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺癌中最重要的表型轉換，EMT 與腫瘤干性、侵襲性和治療抵抗相關[14]。通常認為間充質CTCs 在肺癌患者中與較差的預后及轉移相關[15]。但Fischer 等[16]在乳腺癌動物模型中的研究提示，EMT 并非腫瘤轉移的必要條件，而是參與化療耐藥過程。Liu 等[17]構建轉移性乳腺癌的同源性小鼠模型，研究結果表明以上皮細胞表型為主的CTCs 細胞亞型具有更強的轉移和增殖能力。關于EMT 的研究仍在不斷深入中。

3 PD-L1 在CTCs 表達的臨床意義

根據KEYNOTE-024 試驗結果，在PD-L1 表達≥50%且未發生肺癌驅動基因突變的ⅡB 至Ⅳ期NSCLC 患者中，帕博利珠單抗已獲批準使用于PDL1 表達陽性的患者[18]。但有研究者在臨床使用過程中發現，部分腫瘤活檢PD-L1 陰性患者也會受益于PD-1/PD-L1 抑制劑治療[19]，這說明仍需要繼續探索更精準的方法用以預測治療療效，而CTCs 作為細胞整體可對PD-L1 的表達進行檢測。

從NSCLC 患者中分離的CTCs 評估PD-L1 表達是可行的，但由于檢測技術不同，PD-L1 在CTCs 的檢出率存在較大差異（23.0%~95.0%），已有多項研究表明，CTCs 中PD-L1 的表達與預后不良相關[20-23]，PDL1 表達陽性的CTCs（PD-L1+-CTCs）基線數量高及治療后數量升高通常預示較差的預后。Dong 等[20]在114 例可手術的NSCLC 患者的研究表明，基線肺靜脈PD-L1+-CTCs 與預后不良相關。Boffa 等[21]在112 例NSCLC 患者的研究表明，基線時外周血PDL1+-CTCs>1.1 個/mL 患者的2年生存率為31.2%，而PD-L1+-CTCs≤1.1 個/ mL 的患者2年生存率為78.8%（P<0.01）。Kallergi 等[22]在30 例接受化療的NSCLC 患者中發現，基線PD-L1+-CTCs>3 個/mL 的患者PFS 較短（P=0.02）。同樣，Nicolazzo 等[23]的研究發現，在接受納武利尤單抗治療的患者中，PD-L1+-CTCs 數量增加與疾病進展相關。PD-L1 在CTCs 的表達預示疾病進展這可能與PD-1/PD-L1 介導的免疫逃逸有關。

該研究檢測了PD-L1 在接受納武利尤單抗治療的Ⅳ期NSCLC 患者中CTCs 的表達，在19 例患者治療前檢測出PD-L1+-CTCs，其中僅5 例在治療半年后獲得了臨床獲益。Guibert 等[24]對96 例接受納武利尤單抗治療的NSCLC 患者研究表明，高基線PD-L1+-CTCs（≥1%）的患者與CTCs 中未表達PD-L1 的患者相比，治療效果更差（68%vs.40%，P=0.04）。同樣，Kulasinghe 等[25]也未觀察到PD-L1+-CTCs 與免疫治療效果的相關性。目前的研究表明，CTCs 的PD-L1表達尚無法預測PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效，仍需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 與PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效的關系。

4 CTCs 聯合cfDNA 應用

cfDNA 是指游離于血液中的細胞外DNA，由于cfDNA 的檢測無需預先富集，已成為檢測肺癌治療靶點的常用臨床手段。但血漿中cfDNA 片段的大小分布表明，多數DNA 由凋亡細胞釋放[26]，且在一些良性疾病的血液中也能檢測到較高含量的cfDNA[27]，這可能會限制對治療耐藥的存活腫瘤細胞DNA 的檢測；其次，無法將特定的循環腫瘤DNA（circulating tumor-DNA，ctDNA）與對應的腫瘤細胞進行匹配，限制了腫瘤異質性的評估。

與cfDNA 相比，CTCs 的檢測需要更多技術的發展，但CTCs 作為細胞整體，可以分析來自活性細胞的基因組譜、PD-L1 表達，并且可以通過細胞培養或CDX 實現藥物篩選等。由于CTCs 檢測需要經歷從血細胞中富集的過程，其檢測效能在很大程度上取決于檢測方法的敏感性，而不同技術平臺存在差異，尚需進一步提升檢測技術。相信在檢測技術的支持下，CTCs 作為細胞整體在精準醫學的發展上將有更大的潛能。

Sundaresan 等[28]前瞻性地研究了對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）臨床耐藥的40 例晚期肺癌患者，分別檢測活檢組織標本、CTCs、ctDNA 中T790M 的突變情況。結果表明T790M 突變陽性率分別為63%、50% 和50%，組織與CTCs 中T790M 檢測一致率達74%，與ctDNA 的一致率為61%。將CTCs 聯合ctDNA 用于基因分型，發現14 例（35%）組織活檢不確定或T790M 陰性的患者存在T790M。基于此項研究反映出的液體活檢與腫瘤活檢的差異，表明腫瘤細胞的異質性[29]，同時也證明腫瘤活檢和CTCs、ctDNA 的互補作用，在未來可考慮結合ctDNA 和CTCs 以更全面篩選突變靶點。

5 結語與展望

CTCs 技術發展最大的障礙是低效率以及無標準的檢測系統，技術的限制使其在臨床中的應用不及cfDNA，在未來應重視技術的優化和標準化，并聯合應用CTCs 和cfDNA 以提供更全面的信息[30]。

CTCs 計數與肺癌預后不良相關。目前CTCs 的研究已深入分子層面，各種技術不斷開發被用于CTCs 的研究。CDX 的研究是具有潛力的發展方向，CDX 模型的建立使得體外篩選新的治療藥物成為可能，但對CTCs 的數量要求高，在NSCLC 患者中應用仍有較大難度。近年來，單細胞技術的發展加深了對于腫瘤異質性的理解，通過基因組、轉錄組和表觀遺傳方面的分析，有望為腫瘤轉移、耐藥機制研究及治療新靶點提供重要信息。但是單細胞測序技術本身尚存在局限性，未來還需要單細胞技術的不斷發展和改進。

檢測CTCs 的PD-L1 表達是可行的，但還需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 與PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效的關系。有研究表明免疫檢查點抑制劑的療效可以通過基于ctDNA 的腫瘤突變負荷評估來預測[31]，但其有效性仍在評估中。

本文主要總結了分子層面的CTCs 檢測在肺癌個性化診療的潛在臨床意義。精準醫療作為肺癌發展的趨勢，CDX 模型、單細胞分析及PD-L1 檢測等技術將是未來CTCs 檢測的重點發展方向。但技術障礙仍是阻礙其廣泛應用于臨床的主要原因，因此標準化檢測系統的開發及技術效率的提升是亟待解決的問題。