家畜布魯氏菌病相關疫苗的研究進展

孫天浩，馬忠臣，張 歡，程科建，陳創夫，2，王 震，2*，張 倩

（1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000；2.西部地區高發人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心，新疆石河子832000；3.新疆農墾科學院，新疆石河子832000）

布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌引起的一種嚴重危害人和家畜健康的人獸共患傳染病[1]。布魯氏菌屬于α-變形桿菌，是一種兼性胞內病原菌，能夠感染哺乳動物和人類。反芻動物是易感動物，主要表現為公畜的睪丸炎和附睪炎、母畜的流產和不孕。布魯氏菌病嚴重影響動物的生產性能和繁殖性能。人類布魯氏菌病主要是通過直接接觸布魯氏菌感染的動物或食用未經消毒的動物源性食品或奶制品而感染，造成類似于流感癥狀的波浪熱、脊柱炎、關節炎等非特異性癥狀[2]。布魯氏菌病不僅導致經濟損失、妨礙全球性貿易，而且嚴重威脅公共衛生安全。所以，控制、根除布魯氏菌病已經成為當前經濟和社會發展的重要任務，而疫苗接種是控制該病的主要手段。目前，布魯氏菌疫苗主要分為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、突變株候選疫苗和異源表達疫苗等。文章主要介紹目前存在的布魯氏菌相關疫苗的研究現狀及其保護效果。

1 滅活疫苗

滅活疫苗可以為動物提供安全有效的保護，降低動物的免疫抑制，不污染牛奶和肉類，不引起孕畜的流產[3]。目前，布魯氏菌滅活苗的開發取得一定的成果，主要有牛種布魯氏菌45/20和羊種布魯氏菌53H38滅活疫苗。

1.1 牛種布魯氏菌45/20滅活疫苗

牛種布魯氏菌45/20疫苗的菌種是1種粗糙型菌株，是由牛種布魯氏菌45株在豚鼠體內連續傳代培養20代所獲得，故稱之為布魯氏菌45/20，將其滅活后制成的油包水型滅活疫苗，在20世紀20年代開始使用[4]。該疫苗免疫牛群后，可提供免疫保護作用，并可用于孕畜。由于布魯氏菌45/20滅活疫苗為粗糙型菌株，動物免疫后不產生抗O-鏈多糖的抗體，因此不干擾常規血清學診斷。但是，因為原始的45/20菌株遺傳穩定性差，在體內環境中會轉化成S中間型[5]。而且該疫苗免疫動物后會出現局部反應，各批次間免疫效果差別較大。因此，此種疫苗未推向市場使用。

1.2 羊種布魯氏菌53H38滅活疫苗

20世紀60年代，Glenchur[6]等將S型羊種布魯氏菌菌株H38滅活后，加入礦物油佐劑乳化后接種綿羊，發現該疫苗能夠抵抗布魯氏菌的感染，并保護孕羊避免流產。但是，由該疫苗存在滅活過程中抗原表位易丟失，免疫劑量較大，干擾常規血清學診斷，接種部位容易引起局部反應，不能誘導細胞毒性T淋巴細胞反應等缺點，因此限制該疫苗的大面積推廣。

2 減毒活疫苗

減毒活疫苗對于抵抗胞內病原體具有重要作用，弱毒疫苗可用于控制牛、羊和豬種布魯氏菌病。目前，常用的減毒活疫苗包括牛種布魯氏菌減毒活疫苗S19和RB51；羊種布魯氏菌減毒疫苗Rev.1和M5-90；豬種布魯氏菌活疫苗S2。

2.1 牛種布魯氏菌S19疫苗

牛種布魯氏菌活疫苗S19是1923年發現的天然減毒的光滑型布魯氏菌的突變株。該菌株缺少一個由702 bp編碼的赤蘚醇代謝基因，從而表現出對赤蘚醇的敏感性[7]。S19疫苗已在全球多個地區用于牛布魯氏菌病的預防，目前仍然在印度和阿根廷被廣泛使用。牛種布魯氏菌S19疫苗可產生較高的免疫力，抵抗牛感染布魯氏菌后引起的流產。使用S19疫苗免疫牛群后，約有65%～75%的牛能夠受到完全保護，其余25%～35%的牛群雖然會受到感染，但并不引起流產癥狀[8]。研究表明，S19疫苗能夠阻止70%～91%的牛群發生流產，但其保護效果取決于免疫劑量[9]。減少疫苗劑量的使用未影響抗體滴度的持久性，而且持續時間與全劑量免疫基本相同。因此，Erasmus等[10]建議，在流產布魯氏菌流行的地區減少S19疫苗的使用劑量。然而，在懷孕期間免疫S19卻可引起孕牛的流產，而且在孕期的后3個月使用該疫苗，其流產率明顯高于其他孕期[11]。研究發現，懷孕母牛皮下注射S19疫苗可造成3.2%的流產率，靜脈注射則可導致100%流產，即使降低其使用劑量（標準劑量的1/20到1/100）仍可觀察到流產現象[12]。也有報道稱，使用該疫苗后，奶牛的產奶量降低[5]，而且該疫苗通過受損皮膚和污染的灰塵引起人的感染[13]。

目前，S19疫苗被指定用于犢牛（4～12月齡）的免疫，犢牛接種S19疫苗也存在一定的副作用，如公牛或犢牛的睪丸炎和關節炎等[14]。Wyn-Jones等[15]研究發現，流產布魯氏菌S19的抗原物質存在于免疫動物的膝關節、滑膜和淋巴結中，同時光滑型布魯氏菌疫苗S19由于具有完整的O側鏈抗原，因此產生的抗體不能使用標準的血清學方法區分自然感染和疫苗免疫。因此，目前對S19的改造主要集中在如何降低其毒力，同時保留其良好的免疫原性。最新研究顯示，環1，2-葡聚糖合成酶基因突變株具有疫苗開發潛力的1株候選株，其不僅可產生不依賴于O抗原的免疫反應，也保留其對野生型流產布魯氏菌2308的免疫保護效果[16]。但這些疫苗的研究還有待在動物身上進行驗證試驗。

2.2 牛種布魯氏菌RB51疫苗

1996年，為解決S19疫苗血清學試驗不能區分自然感染和菌苗免疫的缺點，Luis等[17]將牛種布魯氏菌2308株在含有利福平和青霉素的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上培養，篩選出的1株具有利福平耐藥性的粗糙型布魯氏菌菌株RB51。臨床使用表明，RB51疫苗免疫犢牛表現出比其他疫苗更優異的免疫保護效果；其接種犢牛（4～12月齡）后未表現出任何臨床體征，也不會在注射部位引起局部反應。而且在接種2周后細菌即可在血液中被清除，不會從鼻腔分泌物、唾液、尿液中排出，其免疫保護作用通過細胞免疫介導，牛接種該疫苗后在不同布魯氏菌感染環境中，1年內能保護全部動物避免流產。另外，RB51疫苗株的LPS缺少O-側鏈，不會誘導機體產生抗O-側鏈抗體，可通過傳統的血清學檢測，而且RB51的保護效果明顯優于S19疫苗[18]。

RB51疫苗主要用于牛的免疫，也可用于綿羊和山羊，但其對懷孕綿羊的保護力較低，也不能提供足夠的保護力以抵抗綿羊種布魯氏菌的感染[19]。除用于家畜外，RB51疫苗也在野生動物如美洲野牛、駝鹿中使用。研究發現，與未免疫的野牛相比，接種RB51疫苗（1.2×1010～6.1×1010CFUs）后其流產率從62%降低至15%。但RB51疫苗的重復免疫并未增加其免疫保護效果[20]。另有研究表明，RB51對麋鹿具有致病性，可導致71%麋鹿流產[21]。而RB51疫苗的缺點主要表現為對人的感染以及對利福平的耐藥作用[22]。由于利福平是人類治療布魯氏菌病最有效的抗生素[23]，也是妊娠患者、青少年、心內膜炎和神經性布魯氏菌患者使用最為常見的抗生素。因此，該疫苗具有的利福平耐藥作用對于此類人群感染該菌株后的治療極為不利。

2.3 羊種布魯氏菌Rev.1

羊種布魯氏菌Rev.1疫苗被認為是控制羊布魯氏菌病的最好疫苗，目前已經通過世界衛生組織（WHO）和世界動物衛生組織（OIE）的認證[24]。這種疫苗是由光滑型羊種布魯氏菌野毒株6056在含有鏈霉素的培養介質中篩選獲得。因此，該菌株具有鏈霉素抗性。Rev.1疫苗通過皮下注射使用時可產生較高的抗體滴度，但不利于疫苗免疫和自然感染動物的區別。而通過結膜接種后，血清學應答反應較低，有利于免疫動物的區分。因此，Rev.1常采用結膜免疫途徑用于小反芻動物布病的防控。Rev-1疫苗對山羊的保護力可持續4.5年，與未免疫組相比，其組織感染率從92%下降至16%。因此，Rev.1疫苗被多個國家用于布病的防控，如塔吉克斯坦于2004年使用Rev.1對13 006只小反芻動物進行免疫接種。5年后，與未免疫地區相比，布病陽性率下降80%[25]。20世紀末葡萄牙也利用Rev.1疫苗控制本地區的布魯氏菌病，共免疫動物2.4萬頭，畜群的血清陽性率從8.4%下降至1.2%。同時，該疫苗還具有交叉保護的能力，可以抵抗流產布魯氏菌的感染[26]。

Rev.1疫苗在綿羊或山羊布魯氏菌病的防控中發揮重要作用，但也存在某些弊端。如通過皮下注射或結膜免疫的Rev-1均可從母羊陰道分泌物中分離到細菌，而且在泌乳山羊的奶液中檢測到布魯氏菌[27]，Rev-1疫苗仍然具有一定毒力。研究發現，Rev-1疫苗免疫綿羊1 d后即可進入血液中，并在血液中持續存在60 d以上，其菌血癥的持續存在可能使其具有在動物間的傳播能力[26]。此外，Rev-1也可感染人類，尤其是獸醫工作者，而且其毒力比S19疫苗更強。

2.4 羊種布魯氏菌M5-90疫苗

羊種布魯氏菌M5-90疫苗是我國哈爾濱獸醫研究所對布魯氏菌強毒株H28在雞成纖維細胞上連續致弱90代后培育而成的減毒活疫苗。20世紀80年代，石宗舫等[28]對該疫苗在山羊上的免疫效果進行評估，發現該疫苗具有較好的免疫效果，免疫15個月后仍能抵抗布魯氏菌野毒株的感染。該疫苗在免疫效果、抗體消長規律和效價等方面與S2弱毒苗相似，但該疫苗不能用于孕畜的免疫。魯志平[29]使用M5-90疫苗免疫山羊后其流產率高達100%。程君生等[30]對M5-90的毒力進行比較發現，該菌株的毒力高于S2疫苗株和A19疫苗株，說明該疫苗仍具有一定的毒力，對人和動物具有潛在的致病性，而且常規血清學方法難以區分疫苗免疫和自然感染。

2.5 豬種布魯氏菌活疫苗S2

豬種布魯氏菌2號菌株（S2）是從流產母豬體內分離，經過連續傳代獲得的1種光滑型減毒株。自1958年開始，我國將S2疫苗添加到飲水中制成口服疫苗，可有效保護82.7%綿羊、82.1%山羊、75.0%母豬和71.4%奶牛免受感染。連續使用S2疫苗口服免疫豬群2年，可使血清學陽性從62.8%～75.0%降低至0～2.4%。小鼠試驗表明，S2的毒力低于Rev-1和S19，但其仍具有潛在的致病性；S2疫苗與Rev-1和S19疫苗相比，其短期免疫力無顯著差異，但其長期免疫力顯著低于Rev-1和S19疫苗[31]。S2通過結膜免疫雖然可對綿羊提供一定的保護力，但明顯不如Rev-1疫苗[32]，說明S2疫苗可能不適合結膜免疫途徑。

3 布魯氏菌亞單位疫苗

亞單位疫苗不會引起動物的感染和流產，因此對動物和人類是安全的。隨著研究的深入，布魯氏菌的保護性抗原逐漸被挖掘，并將具有免疫原性的布魯氏菌表面分子和抗原成分制成亞單位疫苗。目前，通過小鼠模型對多個亞單位疫苗進行評價，包括嘧啶合成酶、Bp26、InfC、L7/L12、Omp16、Omp19、Omp25、Omp28、Omp31、P39、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶、DnaK、SurA和SodC等。Omp31是布魯氏菌的外膜蛋白，對小鼠模型的感染具有保護作用[33]。非脂化的外膜蛋白Omp19作為亞單位疫苗可產生Th1細胞反應[34]。DNAK和SurA蛋白可誘導產生體液免疫和豐富的細胞毒性反應[35]，脂蛋白L7/L12可誘導Th1細胞因子的產生，產生有效的細胞免疫和體液免疫反應[36]。此外，其他純化的重組抗原也可對布魯氏菌病產生保護作用。研究發現，使用聚微粒包裹綿羊種布魯氏菌外膜蛋白制備的亞單位疫苗免疫公羊后，可產生與Rev.1類似的保護力[37]。利用流產布魯氏菌可溶性抗原和亞甲基十八烷基二甲基溴化銨共同免疫公牛，可誘導機體產生體液免疫和細胞免疫反應。野牛通過肌肉注射免疫Bp26和TFDNA疫苗后，抗體的產生和T細胞增殖能力顯著增強[38]。最近，Leclerq等[39]發現，外膜蛋白（GBOMP）可有效提高小鼠對布魯氏菌的抵抗能力。流產布魯氏菌LPS、外膜蛋白及免疫佐劑的聯合使用可誘導高效的免疫應答反應并抵抗布魯氏菌的感染；布魯氏菌外膜囊泡（GBMOMV）亞單位疫苗不僅是該類疫苗的重要組成成分，而且還具有納米佐劑的作用，可產生較好的免疫保護作用。因此，亞單位疫苗具有較大的發展潛力，而且由于布魯氏菌菌株間的基因同源性高達94%以上。所以，亞單位疫苗可為不同種的布魯氏菌病提供保護作用[40]。

目前，雖然這類疫苗具有一定的保護效果，但其有效性仍低于現有弱毒苗RB51、S19或Rev.1等，而且其制造成本較高。因此，該類疫苗存在一定的局限性。此外，這些疫苗大多通過小鼠模型進行評價，在家畜中的有效性仍需經過大量試驗進行驗證。

4 布魯氏菌DNA疫苗

DNA疫苗可誘導機體的體液免疫和細胞免疫反應（Th1和CTL），并保護機體免受多種病原體的入侵。對布魯氏菌病DNA疫苗的研究顯示，其可誘導強烈的Th1應答反應，對流產布魯氏菌具有一定的抵抗作用[41]。目前，用于布魯氏菌病DNA疫苗的靶基因主要有OMP31、L7、L12、BLS和SOD等，這些布魯氏菌DNA疫苗可在一定程度上預防布魯氏菌的感染[42]，而且其可誘導機體產生單一蛋白的免疫應答，從而有利于布魯氏菌病的臨床診斷。

多個布魯氏菌抗原的聯合表達也是提高該類疫苗免疫保護作用的重要手段之一。研究顯示，同時表達L7、L12和OMP16的DNA疫苗能夠刺激T淋巴細胞的增殖及γ干擾素的釋放，攻毒保護力亦明顯高于單抗原的DNA疫苗。同時表達L7、L12、BCSP31和SOD的DNA疫苗，其抵抗野毒感染的能力高于疫苗株RB51和S19[43]。多抗原串聯表達與細胞因子如白介素的聯合表達是提高該類疫苗免疫效果的另一個重要手段，其可以增強細胞毒性反應和延長免疫保護期。雖然該類疫苗具有安全性高等優點，但至今尚無有效的布魯氏菌DNA疫苗問世。

5 布魯氏菌基因突變株候選疫苗

由于現有布魯氏菌弱毒苗普遍存在安全性低、殘余部分毒力或干擾血清學診斷等缺點。因此，通過基因工程手段對現有弱毒苗的毒力基因或O抗原基因進行缺失突變已成為改造現有疫苗的主要方法。

5.1 流產布魯氏菌突變株候選疫苗

流產種布魯氏菌突變株候選疫苗的研發主要表現為毒力的降低，如構建的脂質A脂肪酸運輸基因bacA突變株、亞鐵螯合酶基因hemH突變株和Ⅳ型分泌系統virB突變株等候選疫苗其毒力均明顯降低，但其保護效果仍有待于進一步研究[44]。磷酸甘油酸酯激酶pgK突變株候選疫苗在小鼠模型中具有同S19和RB51疫苗相同的保護力[45]。野生型布魯氏菌葡萄糖磷酸變位酶pgm突變株和鋅吸收系統znuA突變株候選疫苗具有S19同等的保護效果[46]。而且流產布魯氏菌pgm缺失株候選疫苗產生的抗體不依賴于O側鏈抗原，因此可用于與野毒布魯氏菌的區分[47]。

5.2 羊種布魯氏菌突變株候選疫苗

由于羊種布魯氏菌疫苗Rev.1和M5-90均不能對野毒布魯氏菌進行有效區分，因此對這類疫苗的改造主要集中于LPS的缺失，包括核心多糖和O鏈多糖。研究人員對wa突變株、per突變株和wbkF突變株候選疫苗的研究顯示，在布魯氏菌感染過程中其抵抗母羊流產的能力弱于Rev.1[48]。在另一項研究中，研制的6種羊種布魯氏菌rpoB基因突變株候選疫苗均能夠對小鼠腹腔接種布魯氏菌野毒株的感染起保護作用，其中2株候選疫苗的保護作用類似于Rev.1，且均優于RB51疫苗，而且也不誘導O抗原抗體的產生；隨后研究的14株羊種布魯氏菌LPS基因突變株中的兩株候選疫苗具有與Rev.1相同的保護力，但其接種劑量卻比Rev.1高1 000倍[22]。最近研究發現，口服給藥可能是布魯氏菌減毒的另一個模式；羊種布魯氏菌16MΔznuA疫苗候選株口服免疫后，對鼻內感染羊種布魯氏菌強毒株16M的抵抗力優于RB51疫苗株[49]。

5.3 豬種布魯氏菌突變株候選疫苗

對豬種布魯氏菌突變株候選疫苗的研究主要體現為毒力基因的缺失，如豬種布魯氏菌芳香族氨基酸生物合成基因aroC突變株、布魯氏菌毒力因子bvfA突變株和一氧化氮還原酶norD基因突變株在小鼠模型評價中其毒力明顯減弱。而豬種布魯氏菌赤蘚醇代謝基因eryC和雙組份調控系統ntrC基因缺失株在小鼠體內毒力未發生明顯下降[50]，說明這些突變株并未完全減毒。

6 異源表達的布魯氏菌疫苗

使用活疫苗載體異源表達布魯氏菌保護性抗原可為各種抗原提供有效表達途徑[51]。目前，許多弱毒疫苗載體已被批準用于人類，并被證實是安全的。使用減毒沙門氏菌表達布魯氏菌的L7/L12和嘧啶合成酶融合蛋白的重組活疫苗對抵抗野生型流產布魯氏菌的能力明顯優于重組蛋白[52]。然而，與布魯氏菌活疫苗104M相比，沙門氏菌為基礎的疫苗提供相對較低的保護力。在減毒的豬沙門氏菌中表達流產布魯氏菌保護性抗原BCSP31并通過口服免疫小鼠和豬后，可誘導機體產生免疫反應，但其保護效果不如乳酸球菌中表達流產布魯氏菌L7、L12所產生的IgA滴度高，并且在小鼠模型中的保護效果不如S19[53]。RB51作為一種活疫苗載體重組同源性抗原，以增強其免疫保護力，在RB51中過表達sodC和wboA，可抵抗野生型豬種布魯氏菌1330的侵染[54]。一些病毒載體也被用于布魯氏菌抗原的表達，L7、L12在牛痘病毒中的表達雖然可以誘導抗L7、L12抗體的產生，但免疫保護能力較低[55]。在有復制缺陷的塞姆利基森林病毒中表達流產布魯氏菌轉錄起始因子IF3和sodC，雖然可抵抗野生型流產布魯氏菌2308的感染，但與RB51疫苗相比其保護水平仍然很低[56]。

7 展望

理想的布魯氏菌疫苗應具有安全無毒、免疫效果好，能夠防止兩性動物（公和母）的感染、防止孕畜流產、接種一次疫苗可長期預防、不污染牛奶和肉類等特點。盡管當前布魯氏菌商品苗（主要為弱毒活疫苗）對控制和預防動物布魯氏菌病是有效的，但仍需要對其安全性和毒力進行優化和改善。隨著布魯氏菌全基因組序列的完成，越來越多的功能基因被不斷發現和研究，必將會有更多的靶基因可以用于疫苗的改造或利用，這也為開發具有應用前景的布魯氏菌新型疫苗提供更廣泛的空間。